基于序列分析揭示土耳其环形泰勒虫Tams1基因高多样性与18S rRNA高度保守性研究

本研究针对土耳其环形泰勒虫(Theileria annulata)分子诊断中因靶标区域变异导致的漏检问题，开展了18S rRNA和Tams1基因的遗传多样性分析。发现18S rRNA高度保守(单倍型)，而Tams1呈现高多样性(27个单倍型，Hd=0.988)。结果表明需将多态性标记纳入监测策略，为改善流行病学监测提供关键依据。

　　

在热带和亚热带地区，一种名为环形泰勒虫（Theileria annulata）的顶复门原虫通过璃眼蜱传播，引起牛热带泰勒虫病，造成严重的畜牧业经济损失。土耳其作为地中海盆地的重要 endemic region（地方性流行区域），每年因该病导致的损失可达数十万美元。传统的控制手段如化学治疗、蜱虫管理和活疫苗都存在局限性，特别是疫苗生产和诊断敏感性方面的不足，促使科学家们从分子层面深入探索寄生虫的流行病学和遗传变异特性。

此前研究中出现了一个有趣的现象：使用通用引物检测为阳性的样本，在用物种特异性引物（包括针对Tams1基因的引物）检测时却呈阴性。这暗示当地环形泰勒虫种群可能存在显著的遗传变异，导致常规分子诊断方法出现漏检。为了澄清这一问题，研究人员开展了一项针对两个分子标记的比较研究——一个是高度保守的18S rRNA基因，另一个是高度多态的Tams1基因。

这项研究发表在《BMC Veterinary Research》，旨在阐明土耳其环形泰勒虫的遗传结构和种群动态，为开发更有效的诊断方法和控制策略提供科学依据。

研究人员采用了几个关键技术方法：从土耳其8个省份的36头牛采集血液样本并提取基因组DNA；使用特异性引物通过PCR扩增18S rRNA（812 bp）和Tams1基因（785 bp）；对扩增产物进行Sanger测序；利用BLAST进行序列比对和物种鉴定；通过DnaSP v6软件分析种群遗传多样性（包括单倍型多样性Hd、核苷酸多样性π）和 neutrality tests（中性检验，如Tajima's D、Fu's Fs）；使用MEGA X构建系统发育树（采用Maximum Likelihood方法）；并借助PopART构建单倍型网络。

研究结果首先通过PCR扩增和序列分析成功从所有样本中获得18S rRNA（717 bp）和Tams1（584 bp）基因序列，经BLAST确认均为环形泰勒虫，序列已提交GenBank。

单倍型分析显示，18S rRNA基因区域所有36条序列完全一致，仅形成一个单倍型，表明该基因高度保守。相反，Tams1基因的34条序列呈现出27个 distinct haplotypes（独特单倍型），单倍型多样性极高（Hd=0.988±0.010），核苷酸多样性为π=0.03072±0.00199。单倍型网络分析中，18S rRNA所有序列聚集于一个中心单倍型，而Tams1则呈现分散模式，无主导单倍型，其中74.07%为 unique haplotypes（独特单倍型）。

中性检验和多样性分析进一步揭示了两个基因区域的进化动态。18S rRNA的Tajima's D值为中性（≈0），符合中性进化模型。Tams1基因则表现出显著正值的Tajima's D（2.04089; P<0.05），暗示 balancing selection（平衡选择）或种群瓶颈后中等频率等位基因的积累；Fu's Fs值为显著负值（-5.685; P=0.002），表明种群近期扩张或存在稀有单倍型。这些结果支持Tams1基因处于活跃的进化过程中。

序列比对和系统发育分析确认了Tams1基因区域的43个多态位点（与参考序列AJ276654比对）。系统发育树（基于T92+G+I模型）显示27个Tams1单倍型广泛分布于不同分支，表明土耳其环形泰勒虫种群具有 high genetic differentiation（高遗传分化），且变异模式与地理分布无关。18S rRNA系统发育树（基于T92+G模型）显示所有序列与来自土耳其、埃及、意大利、中国等多个国家的 isolates（分离株）聚为一支，遗传结构高度同质， bootstrap values（自展值）高，增强了分析可靠性。

研究的结论和讨论部分强调，这是土耳其首次采用基于序列的方法同时评估保守和多态分子标记，以表征环形泰勒虫的遗传结构。研究发现18S rRNA基因高度保守，适合物种鉴定，而Tams1基因则表现出极高的遗传多样性，适用于种群水平变异评估。这种差异凸显了仅依赖保守靶标进行分子诊断的局限性，可能导致漏检。高单倍型多样性和中性检验结果暗示当地种群可能正处于进化扩张阶段，受到地区特异性选择压力（如宿主适应、免疫逃逸）的影响。

结果对诊断和疫苗开发具有直接意义：Tams1作为 immunodominant（免疫显性）表面抗原，是潜在的亚单位疫苗候选，但其高度多态性可能限制诊断 assay（检测）的敏感性和疫苗有效性。因此，在制定控制策略时，需考虑地区流行的抗原变异体。研究建议扩大地理范围和宿主物种的分子监测，以提供更全面的数据，支持土耳其兽医和研究人员开发更有效、本地化的干预措施。

研究的局限性包括样本仅来自8个省份，可能不能完全代表全国遗传景观；仅使用两个遗传标记限制了分辨率；缺乏时间序列数据难以推断进化趋势。未来研究应覆盖更广地理范围，纳入更多分子标记和纵向采样。