MIR168a启动子自然变异调控水稻稻瘟病抗性与农艺性状的分子机制

《Rice》：Natural variation of the MIR168a promoter influences its activity and miR168a abundance in rice

本研究针对水稻MIR168a启动子调控机制不清的问题，系统解析了其自然变异对miR168a表达及稻瘟病抗性的影响。通过分析4000余份水稻种质，发现启动子存在三种单倍型，其中Hap2和Hap3因关键位点（T/A）而具有更高活性，导致miR168a表达升高。群体遗传分析表明高活性启动子主要存在于籼稻且源自野生稻，栽培稻中较低的核苷酸多样性暗示了人工选择偏好低活性单倍型。该研究为通过启动子编辑平衡抗病性与产量提供了新策略。

　　

在粮食安全面临日益严峻挑战的今天，水稻作为全球半数人口的主食，其稳产高产至关重要。然而，稻瘟病（Magnaporthe oryzae）作为水稻的“癌症”，每年造成巨大的产量损失。植物除了依靠传统的抗病（R）基因外，还拥有一套精细的、由小分子RNA（microRNA, miRNA）介导的免疫调控网络。在这个网络中，miR168a扮演着一个“指挥官”般的角色，它通过调控ARGONAUTE 1（AGO1）——这个RNA诱导沉默复合体（RISC）的核心蛋白——的表达，间接影响整个miRNA通路的功能。先前的研究表明，过表达miR168a会使得水稻对稻瘟病更为敏感，同时推迟开花并降低产量；反之，抑制miR168a则能增强抗病性、增加分蘖、提早开花并提高产量。这凸显了miR168a在平衡水稻免疫与生长发育中的关键地位。然而，究竟是什么在控制miR168a本身的“开关”——即其基因（MIR168a）的启动子活性，至今仍是一个未被完全解开的谜团。启动子区域的自然变异如何影响其活性，进而影响水稻的抗病性和农艺性状，是育种实践中亟待回答的科学问题。

为了解开这个谜题，赵志学等人发表在《Rice》上的研究，开展了一系列深入探索。研究人员首先确认了MIR168a确实会响应病原相关分子模式（PAMPs，如flg22和几丁质）以及稻瘟病菌GZ8小种的侵染，其表达量在处理后显著上升，表明它积极参与了水稻的免疫应答。为了精确定位启动子的核心功能区，他们构建了不同长度的MIR168a启动子片段（最长2313 bp，最短205 bp），并将其与荧光素酶（LUC）报告基因融合，通过农杆菌（Agrobacterium）介导的瞬时表达技术在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中进行活性检测。结果发现，1661 bp的片段显示出最强的启动子活性。此外，通过构建MIR168a启动子驱动β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因的转基因水稻，他们证实该启动子在幼苗的各个组织（包括 coleoptiles、胚根、叶片、叶鞘和根）中均有活性，并且能被PAMPs显著诱导。

研究的核心部分在于对MIR168a启动子自然变异的深入挖掘。研究人员对来自RiceVarMap等数据库的超过4000份水稻种质的基因组数据进行了生物信息学分析。他们发现，尽管成熟的miR168a序列高度保守，但其启动子区域却存在丰富的单核苷酸多态性（SNPs）和插入缺失（InDels）。基于这些变异，MIR168a启动子被划分为三种主要的单倍型（Hap1, Hap2, Hap3）。有趣的是，地理分布分析显示，Hap1在全球范围内广泛分布，而Hap2和Hap3则主要集中在亚洲、东非和西非地区，在北美、南美、南非和欧洲较为少见，暗示了人工选择可能更倾向于Hap1。

那么，不同的单倍型是否真的功能迥异？研究人员从代表不同单倍型的水稻材料（如Hap1的代表品种LTH、Nipponbare；Hap2的代表品种Digu；Hap3的代表品种Yixiang 1B）中克隆了MIR168a启动子，并利用双荧光素酶报告系统（以35S启动子驱动的海肾荧光素酶RLUC作为内参）进行活性比较。结果清晰地表明，Hap2和Hap3的启动子活性显著高于Hap1。相应地，茎环逆转录定量PCR（stem-loop RT-qPCR）检测也发现，携带Hap2和Hap3的水稻材料中，成熟miR168a及其初级转录本（pri-miR168a）的丰度也显著高于Hap1材料。这证实了启动子活性的差异直接决定了miR168a的表达水平。

为了找到导致活性差异的“罪魁祸首”，研究人员通过序列比对，在启动子区域锁定了一个关键的“核心区域”（Key Region, KR）。通过巧妙的片段交换实验（将Hap1的KR与Hap2或Hap3的相应区域互换），他们证实正是KR内的变异决定了启动子活性的高低。进一步的定点突变研究揭示了其中的关键位点：在Hap2中，KR内一个“CC”到“TT”的变异（称为T位点）是提高活性的关键；而在Hap3中，一个“CCCC”到“A”的变异（称为A位点）起到了同样的作用。将Hap1背景下的“CC”突变为“TT”，或其“CCCC”突变为“A”，能显著提升启动子活性；反之，将Hap2或Hap3中的关键位点回复突变，则会使其活性大打折扣。

这些高活性的启动子单倍型从何而来？群体遗传学分析给出了答案。Hap2和Hap3主要存在于籼稻（indica）中。通过比较栽培稻和33份野生稻的MIR168a启动子序列，研究人员发现栽培稻中该启动子的核苷酸多样性远低于野生稻，这强烈暗示了在驯化和人工选择过程中，某些变异被固定下来。系统发育和单倍型网络分析进一步证实，Hap2和Hap3中的T位点和A位点均起源于野生稻。这意味着，在漫长的驯化史上，人类可能无意或有意地选择了携带低活性Hap1启动子的水稻品系，这可能是因为较低的miR168a水平更有利于平衡抗病性和产量等农艺性状。

最后，研究人员探究了不同单倍型对稻瘟病菌侵染的响应模式。尽管不同单倍型材料中miR168a被诱导表达的时间和峰值存在差异，但在所有测试的材料中，无论是感病还是抗病相互作用，稻瘟病菌GZ8的侵染均能诱导miR168a的表达。这表明M. oryzae诱导miR168a表达是一个普遍现象，并不依赖于特定的启动子单倍型。

关键技术方法概览

本研究综合利用了生物信息学（对4000余份水稻种质进行启动子单倍型和核苷酸多样性分析）、分子生物学（双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性、茎环RT-qPCR检测miRNA表达）、遗传学（转基因水稻材料MIR168apro::GUS的构建与分析）和植物病理学（稻瘟病菌GZ8侵染实验和PAMP处理）等多种技术手段。核心实验技术包括基于农杆菌瞬时转化的启动子活性分析、关键调控位点的定点突变验证、以及跨水稻种质的基因表达模式关联分析。

研究结果

MIR168a响应病原相关分子模式和稻瘟病菌

研究发现，用flg22和几丁质（chitin）处理水稻幼苗，以及在接种稻瘟病菌（M. oryzae）GZ8菌株后，三个不同遗传背景的水稻材料（NPB, LTH, R2115）中的miR168a和其初级转录本pri-miR168a的表达量均出现显著上调。这表明MIR168a积极参与了水稻对病原菌入侵的早期识别和防御反应。通过GUS组织化学染色和荧光活性测定，进一步证实MIR168a启动子在水稻根和叶中均有活性，并能被PAMPs有效诱导。

1.6-kb启动子对MIR168a最大表达至关重要

通过构建不同长度的MIR168a启动子-LUC融合载体，研究人员发现1661 bp的上游片段具有最强的驱动LUC表达的能力，而更短的片段（如661 bp和448 bp）活性显著降低。这表明启动子中存在关键的顺式作用元件（cis-regulatory elements, CREs），其完整性和相对位置对维持高水平的转录活性至关重要。

MIR168a启动子呈现三种具有全球分布的单倍型

对大规模水稻基因组数据的分析显示，MIR168a启动子存在大量多态性，可划分为三种主要单倍型（Hap1, Hap2, Hap3）。Hap1在全球分布最广，而Hap2和Hap3则呈现出明显的地理局限性，主要集中于亚洲和非洲的特定区域。这种分布模式提示人类活动（如驯化和育种）可能对MIR168a启动子的变异进行了选择。

MIR168a启动子单倍型表现出差异活性

功能实验证实，不同单倍型确实具有不同的生物学功能。来自Hap2和Hap3材料的启动子，其驱动LUC报告基因表达的活性显著高于Hap1材料。与此一致，携带Hap2和Hap3的水稻材料中，miR168a的实际表达量也更高。这建立了启动子基因型（单倍型）与表型（miR168a表达水平）之间的直接联系。

MIR168a启动子的“关键区域”对最大启动子活性至关重要

通过设计精巧的启动子片段交换实验，研究人员将关注点聚焦于一个被称为“关键区域”（KR）的短片段。当把Hap2或Hap3的KR片段置换到Hap1的启动子中时，嵌合启动子的活性变得与高活性的Hap2或Hap3相似；反之，将Hap1的KR置换到Hap2或Hap3中则会降低其活性。这证明KR是决定单倍型间活性差异的核心区域。

Hap2中的T位点和Hap3中的A位点是影响MIR168a启动子活性的关键调控元件

在KR内，研究人员通过序列比对识别出具体的核苷酸变异位点。随后的定点突变实验提供了决定性的证据：在Hap1背景下，将位点3的“CC”突变为Hap2特有的“TT”（T位点），能显著增强启动子活性；而在Hap2背景下将“TT”回复突变为“CC”，则活性降低。同样，在Hap1背景下将位点4的“CCCC”突变为Hap3特有的“A”（A位点）能增强活性，在Hap3背景下将“A”回复突变为“CCCC”则削弱活性。这明确地将特定的核苷酸变异与功能差异联系起来。

MIR168a启动子的T和A位点源自野生稻

进化分析表明，携带高活性T位点和A位点的Hap2和Hap3单倍型主要存在于籼稻（indica）中。更重要的是，对野生稻材料的序列分析发现，这些关键位点同样存在于野生稻的MIR168a启动子中。系统发育分析和单倍型网络构建进一步支持了栽培稻中的这些高活性等位基因起源于野生稻。同时，栽培稻群体中MIR168a启动子的核苷酸多样性显著低于野生稻群体，这强烈暗示了在驯化和人工选择过程中，人类可能更倾向于选择活性较低的Hap1单倍型，这可能是因为较低的miR168a水平更有利于综合性状的优化。

miR168a在所有水稻单倍型中均响应稻瘟病菌侵染

尽管不同单倍型背景下的水稻材料对稻瘟病菌GZ8的抗感性不同（存在相容和不互作），但病原菌侵染均能诱导所有测试材料中miR168a的表达，只是诱导的时间和峰值存在差异。这表明M. oryzae诱导MIR168a表达是一个相对保守的机制，其上游信号通路可能独立于启动子单倍型所依赖的特定转录调控。

结论与展望

赵志学等的研究系统阐明了水稻MIR168a启动子自然变异的规律、功能及其进化起源。该研究首次发现并证实了MIR168a启动子存在三种功能迥异的单倍型，其中Hap2和Hap3因拥有关键核苷酸位点（T/A）而具有更高的转录活性，从而导致miR168a表达水平升高。群体遗传学证据表明，这些高活性等位基因源于野生稻，但在栽培稻驯化过程中，人类可能更倾向于选择活性较低的Hap1单倍型，以实现抗病性与产量等农艺性状的最佳平衡。

这项研究的意义重大。首先，它深化了我们对miRNA表达调控机制的理解，将非编码RNA的研究从成熟的序列功能拓展到了其转录调控的遗传基础。其次，研究鉴定出的关键调控位点（T/A site）为分子育种提供了宝贵的遗传标记和操作靶点。通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术，对MIR168a启动子进行精准编辑，有望在不改变miR168a编码序列的前提下，微调其表达水平，从而打破抗病性与产量等性状间的负相关，培育出兼具广谱抗病性和高产潜力的水稻新种质。这为应对未来粮食安全挑战，实现作物性状的精准设计育种开辟了新的途径。