YcfA-YcfC系统介导6-硫鸟嘌呤生物合成中硫酰胺形成的机制解析与抗菌应用探索

本刊推荐：为解决6-硫鸟嘌呤（6-TG）生物合成关键硫酰胺基团形成机制不明的问题，研究人员聚焦YcfA-YcfC系统开展酶催化机制研究。通过结构生物学与功能分析，揭示了YcfA通过两步催化（腺苷化与L-半胱氨酸加成）形成S-加合物，YcfC作为C-S裂解酶催化硫酰胺生成；发现GTP双重调控组装与活性，PLP通过竞争性结合调控酶活性；成功合成具抗菌活性的6-硒代GTP。该研究为硫酰胺生物合成提供了新范式，为药物开发提供新策略。

　　

在微生物代谢产物的宝库中，硫酰胺类化合物因其独特的生物活性而备受关注。这类化合物中的硫原子取代了传统酰胺中的氧原子（C(=S)NH），赋予了它们多样的药理特性，包括抗菌和抗癌作用。其中，6-硫鸟嘌呤（6-TG）作为一种重要的代谢产物，不仅是治疗儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的临床药物，还对金黄色葡萄球菌等病原体表现出显著的抗菌活性，甚至对冠状病毒也有抑制效果。然而，尽管6-TG的重要性不言而喻，其生物合成途径中关键硫酰胺基团的形成机制长期以来却笼罩在迷雾之中。

传统的硫酰胺生物合成通常依赖于复杂的硫转移系统，涉及半胱氨酸脱硫酶和persulfide中间体，需要多种蛋白质协同作用。然而，在解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）中，YcfA-YcfC系统却展示了一种更为精简的合成策略。前期研究表明，这个系统可能绕过了传统的persulfide途径，直接利用L-半胱氨酸进行核苷酸修饰。但是，这一过程的具体分子机制、酶如何协同工作、以及系统如何调控等关键问题仍未得到解答。这些谜题的答案不仅对于理解自然界中硫酰胺生物合成的多样性具有重要意义，更为设计和开发新型含硫/硒生物活性分子提供了潜在靶点。

为了揭开这一合成机制的神秘面纱，研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果，通过对YcfA-YcfC系统的全面生化与结构表征，揭示了硫酰胺形成的新机制。研究团队发现，YcfA能够组装成独特的双层七聚体结构，催化腺苷化和L-半胱氨酸加成两个关键步骤，而YcfC则作为C-S裂解酶负责最终产物的生成。令人惊讶的是，GTP在这一过程中扮演着底物和寡聚化增强子的双重角色，而YcfC的辅因子磷酸吡哆醛（PLP）虽然能够促进YcfA的组装，却会通过阻碍GTP结合来抑制其活性，展现了一种精巧的反馈调节机制。此外，研究人员还成功合成了6-硒代GTP，并发现其对耐药金黄色葡萄球菌具有强大的抗菌作用，通过多组学分析揭示了其抗菌机制，为开发新型抗菌药物提供了新思路。

研究人员主要运用了以下几项关键技术：通过X射线晶体学解析了YcfA的apo状态及与ATP、GTP复合物的高分辨率结构，以及YcfC与PLP复合物的结构；利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）揭示了YcfA的双层七聚体组装结构；采用高效液相色谱（HPLC）和高分辨率质谱（HRMS）对反应产物进行定性和定量分析；通过分子对接和分子动力学模拟研究了底物结合和催化机制；使用等温滴定 calorimetry（ITC）分析蛋白质与底物的结合亲和力；通过尺寸排阻色谱（SEC）和 analytical ultracentrifugation（AUC）研究蛋白质的寡聚化状态；利用体外重组实验验证酶活性；通过微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）；并整合代谢组学、转录组学和蛋白质组学多组学方法分析6-硒代GTP的抗菌机制。

体外重组YcfA-YcfC系统

研究人员首先在体外重组了YcfA-YcfC系统，使用不同的底物（包括硫源L-半胱氨酸和硒源L-硒代半胱氨酸）以及鸟嘌呤核苷酸（GTP、GDP和GMP）。结果显示，YcfA、YcfC、ATP、Mg²⁺和L-Cys与各种鸟嘌呤核苷酸反应后，均产生了在340 nm处有特征吸收峰的产品，经HPLC和HRMS鉴定为6-硫代GTP、6-硫代GDP和6-硫代GMP。当使用L-SeCys代替L-Cys时，则产生了相应的6-硒代鸟嘌呤核苷酸，其吸收峰红移至360 nm。通过顺序添加酶的实验，研究人员发现YcfA首先催化形成315 nm中间体，随后YcfC将其转化为340 nm的最终产物6-硫代GTP。进一步分析表明，ATP、GTP和L-Cys是形成315 nm中间体的必需因素，而只有含硫醇基的氨基酸（L-Cys）或巯基丙酮酸（3MP）能够产生该中间体，证实了硫醇基团在亲核攻击中的关键作用。质谱分析最终确定该中间体为6-Cys-GTP S-加合物。

YcfA在腺苷化和L-Cys加合物形成中的双重作用

通过解析apo-YcfA、YcfA-ATP复合物、YcfA-GTP复合物以及YcfA^D19A-ATP-GTP复合物的晶体结构，研究人员揭示了YcfA独特的双层七聚体结构。催化空腔位于两个七聚体层相邻单体的界面处，形成催化二聚体单元。在YcfA-ATP复合物结构中，ATP深埋于催化空腔内，与Asp19、Gln129和Glu183形成关键氢键，稳定ATP裂解的过渡态。而在YcfA-GTP结构中，GTP结合在催化空腔入口附近，其鸟嘌呤环与Phe132和Glu134相互作用，三磷酸尾则与相邻单体的Arg18、Lys169和Lys180结合。YcfA^D19A-ATP-GTP复合物结构揭示了ATP和GTP的协同结合，其中Gln135通过与ATP的α-磷酸和GTP的鸟嘌呤碱基相互作用来对齐底物。分子对接模拟表明，腺苷化GTP在焦磷酸释放后发生构象变化，为L-Cys结合创造空间。L-Cys的羧酸基团由Arg18锚定，Tyr128和Gln129稳定其方向，Gln129可能通过去质子化L-Cys来促进硫醇亲核攻击。

十四聚体组装对YcfA活性至关重要

研究发现YcfA采用罕见的十四聚体（双层七聚体）排列，这一结构通过晶体结构和cryo-EM得以揭示。通过针对寡聚化界面的突变研究，研究人员发现L173D突变导致稳定的二聚体形成但无酶活性，而D166R/Y170N双突变则通过增强界面稳定性促进了十四聚体组装并提高了催化效率。SEC分析显示，YcfA的寡聚化具有浓度依赖性，而ATP和GTP能够促进组装，其中GTP的效果更强。GTP的结合特性解释了其更强效应：GTP结合在催化界面，其鸟嘌呤碱基与一个单体相互作用，而磷酸尾则与相邻单体的Lys169、Lys180和Arg18结合，这种单体间连接对GTP诱导的组装至关重要。

GTP通过竞争性结合促进YcfA组装

研究人员发现PLP（YcfC的辅因子）能够以与GTP类似的方式促进YcfA组装。SEC分析显示PLP与YcfA共洗脱，表明存在共价连接，质谱分析将这一连接定位于Lys169。由于Lys169也介导GTP相互作用，PLP在该位点的结合显著破坏了GTP的招募。虽然PLP诱导的寡聚化组织与GTP相似，但它通过阻断底物结合来抑制YcfA的酶活性。这种抑制可能作为YcfA-YcfC系统内的一种反馈机制，在缺乏YcfC时防止ATP、鸟嘌呤底物、硫源和不稳定中间体的浪费。

YcfC C-S裂解酶的结构基础

YcfC与PLP复合物的晶体结构显示，YcfC形成同源二聚体，每个单体由大小两个结构域组成，创建两个相同的活性位点，容纳PLP辅因子和底物。PLP与Lys148形成共价希夫碱键，并通过π堆叠和氢键网络稳定。分子对接模拟揭示了YcfC的底物识别机制：Tyr19与鸟嘌呤碱基形成π-π堆叠相互作用，Glu179与核糖羟基形成氢键，而带正电荷的区域（包括Arg17、Lys20、Lys77等）可能促进与底物磷酸基团的静电相互作用。基于结构分析和突变研究，研究人员提出了YcfC催化C-S键裂解的详细机制，涉及His147作为通用碱去质子化底物的α-胺基，促进外部醛亚胺形成，以及Lys148介导的质子转移反应。

6-硒代GTP的抗菌活性及潜在机制

基于6-硫鸟嘌呤对金黄色葡萄球菌的抗菌效果，研究人员研究了酶法合成的6-硫代GTP和6-硒代GTP对ESKAPE病原体的抗菌潜力。结果显示，6-硒代GTP对金黄色葡萄球菌表现出强效抗菌作用，而6-硫代GTP的活性可忽略不计。通过对经6-硒代GTP处理的金黄色葡萄球菌Newman菌株进行多组学分析，发现差异表达的代谢物主要涉及氨基酸、核苷酸和嘌呤代谢；转录组分析显示差异表达基因与嘌呤、氨基酸和维生素B₆代谢相关，并富集于糖酵解/糖异生、双组分信号和群体感应通路；蛋白质组学发现差异表达蛋白包括上调的转运蛋白和转录调节因子，以及下调的渗透酶和反向转运蛋白。整合分析表明，6-硒代GTP显著上调了嘌呤生物合成基因（purQ、purF等）和精氨酸代谢基因（arcA、arcB），同时显著下调了冷休克蛋白cspC，提示其通过破坏嘌呤和精氨酸代谢以及削弱应激反应通路来抑制金黄色葡萄球菌。

本研究系统阐明了YcfA-YcfC系统在硫酰胺生物合成中的独特机制，颠覆了传统的persulfide转移模型。YcfA通过直接利用L-半胱氨酸形成S-加合物，YcfC作为C-S裂解酶催化最终产物的生成，这一途径避免了反应性persulfide中间体的需要，代表了硫酰胺化的一种生化创新。研究揭示了YcfA的动态寡聚化调控机制，其中核苷酸底物和PLP通过竞争性结合施加相反影响，确保催化过程的高效和同步。这种调控可能使解淀粉欧文氏菌能够在不同代谢条件下动态平衡6-TG生产，将其生物合成与毒力调节联系起来。此外，6-硒代GTP的强效抗MRSA活性及其对细菌关键代谢通路的破坏作用，为开发针对耐药性细菌感染的精准抗菌剂提供了新途径。从应用角度看，对YcfA寡聚化机制的深入理解为工业规模生产6-TG提供了潜力，而该系统的模块化特性（能够掺入硫和硒）为生成多样化的硫酰胺和硒代酰胺库用于药物发现打开了新机遇。总之，该研究不仅增进了我们对硫酰胺生物合成的理解，也为药物开发和合成生物学应用奠定了坚实基础。