有丝分裂期TMEJ通路修复DNA损伤可抑制复制应激诱导的核膜重组缺陷

本刊推荐：为探索复制应激(RS)与核膜(NE)完整性之间的关系，研究人员开展了关于有丝分裂期DNA修复与核膜重组缺陷(NERD)的机制研究。发现RS通过诱导Lamin A/C持续磷酸化破坏核纤层相关结构域(LADs)与NE的相互作用，而DNA聚合酶θ(Polθ)介导的TMEJ通路可修复有丝分裂期DNA损伤从而抑制NERD。该研究首次建立了基因组不稳定性与核膜脆弱性之间的直接联系，为癌症治疗中合成致死策略提供了新见解。

　　

在细胞周期过程中，DNA复制和染色体分离是两个核心事件。正常情况下，这两个过程在时间上和空间上被严格调控，确保基因组的稳定性。然而，当细胞遭遇复制应激(Replication Stress, RS)时——这种应激可能由癌基因激活、DNA损伤剂暴露或核苷酸耗竭引起——始于S期的复制扰动会持续到有丝分裂期，导致染色体粉碎、微核形成和染色体桥等 detrimental 后果。这些事件往往伴随着复制叉崩溃、DNA双链断裂(DSBs)以及灾难性的基因组重排，如染色体碎裂(chromothripsis)和 kataegis。尽管这些现象已被广泛观察，但其背后的分子机制仍不清楚。

一个突出的问题是：有丝分裂期间如何应对RS及其导致的DSBs？在间期，DSBs可以通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)进行修复，但这些经典通路在有丝分裂期基本处于失活状态。目前提出两种模型来解决"有丝分裂期DNA合成"的问题：一是MUS81-EME1、SLX4、POLD3和RAD52等酶介导的MiDAS（有丝分裂期DNA合成）途径，利用断裂诱导复制(BIR)机制处理复制叉并触发半保守复制；二是DNA聚合酶θ(Polθ, 由POLQ基因编码)介导的TMEJ（theta介导的末端连接）通路，负责连接提前进入有丝分裂期的崩溃复制叉产生的DSB末端。此外，TMEJ还修复常见脆弱位点(CFSs)的染色体断裂，并在有丝分裂期解决复制阻断剂的问题，尽管这种方式容易出错。最近的研究还表明，在整个有丝分裂过程中，Polθ/TMEJ（而非MiDAS）介导RS诱导的CFSs结构变异形成。尽管这些通路操作方式不同，但MiDAS和TMEJ并非互斥，它们共同作为防止子代细胞染色体不稳定的最后保障。

除了染色体分离之外，有丝分裂中另一个显著的形态学变化是核膜(NE)的破裂和重组。进入有丝分裂时，包括Lamin A/C和Lamin B1在内的纤层蛋白被磷酸化，导致它们解聚并释放其在核纤层相关结构域(LADs)上结合的染色质，从而引起NE破裂和染色体凝缩。在后期染色体分离后不久，纤层蛋白去磷酸化并重新聚合以进行NE重组，使NE重新与染色质结合形成LADs。值得注意的是，在组装过程中，NE在末期暂时形成两个不同的域：与有丝分裂纺锤体接触的染色质上组装的NE膜形成"核心"域，并积累核心蛋白（包括Lamin A/C、屏障自整合因子(BAF)和与BAF相互作用的含LEM结构域的蛋白）；远离纺锤体的膜形成"非核心"NE域，并招募非核心蛋白，包括核孔复合物(NPCs)、Lamin B1及其受体LBR。在有丝分裂结束时，ESCRT（运输所需的内体分选复合物）蛋白CHMP7和跨膜ESCRT适配器LEM2经历液体样凝聚，在膜、染色质和纺锤体汇合处形成大分子O环密封，最终完成核膜重组。

NE缺陷常常导致破裂位点的DNA损伤，并 contributes to 肿瘤侵袭和各种人类疾病，包括 laminopathies 和 aging。然而，在复制应激下，NE完整性和动力学如何响应基因组不稳定性仍不清楚。本研究报道了一个有趣的现象：核膜重组缺陷(NERD)与有丝分裂期DNA损伤相关，并可被Polθ TMEJ抑制。通过使用CUT&Tag技术对LADs进行基因组作图，发现了对复制应激敏感的LADs（Replication Stress Sensitive LADs, RESSLADs）。在NERD位点发生Lamin B1的持续磷酸化和降解。因此，这些发现 bridging the gap between 基因组不稳定性与RS下的NE缺陷。

为了研究RS对NE完整性的影响，研究人员将中等浓度(0.4μM)的DNA聚合酶抑制剂蚜栖菌素(APH)应用于稳定表达GFP标记BAF（核完整性标记物）的人RPE-1细胞。与之前报道一致，APH诱导的轻度RS导致染色体错误分离和微核形成。有趣的是，APH处理还导致具有GFP-BAF焦点的细胞增加四倍（从~6.7%增至~27.1%），表明轻度RS可诱导NE缺陷。这种NE缺陷与APH剂量呈正相关，在0.4μM时达到峰值。然而，当细胞在高剂量APH下积累于S期时，缺陷率下降。此外，RS诱导的NE缺陷在多个细胞系（包括HeLa、U2-OS和HCT-116）中均被观察到。

通过针对纤层蛋白的免疫荧光实验证实了GFP-BAF焦点所指示的NE缺陷。结果显示，在APH处理下，Lamin B1在GFP-BAF焦点处缺失，与DMSO处理组中连续的核周边形成对比。除了GFP-BAF外，还使用其他报告基因（包括RFP-NLS、RFP-NLS GFP-BAF双报告系统和cGAS-mNG）来确认RS对NE完整性的影响。APH处理使细胞质中RFP-NLS的细胞从6.6%增加至~20%，且不受GFP-BAF的影响。值得注意的是，RFP-NLS GFP-BAF双报告系统（细胞质RFP-NLS与GFP-BAF焦点）将背景显著降低至1.5%，而APH处理使NE缺陷增加至15.1%。同时，APH处理诱导具有cGAS-mNG焦点的细胞显著增加（从4.2%至19.5%），这些焦点与BAF焦点共定位。需要注意的是，不同报告系统的NE缺陷基线 vary，表明其敏感性、固有局限性和潜在副作用存在差异。尽管如此，所有这些系统都验证了RS触发NE缺陷的显著增加。

通过透射电子显微镜(TEM)在更高分辨率下检查了NE的结构。对照细胞中NE的双层结构完整，而在轻度RS处理的细胞中观察到 gaps。令人惊讶的是，与Lamin B1不同，Lamin A/C在GFP-BAF焦点处表现出强烈富集和共定位，表明Lamin A/C在响应RS诱导的NE缺陷中具有独特作用。GFP-BAF的表达水平比内源性BAF蛋白高约10倍，APH诱导其表达增加约1.4倍，但不影响细胞增殖。为了进一步排除GFP-BAF的潜在副作用，在不含GFP-BAF的WT细胞中进行了内源性BAF和纤层蛋白的免疫荧光实验。结果表明，APH处理诱导内源性BAF焦点的形成，并伴随Lamin B1的耗竭和Lamin A/C的富集。

此外，还检测了纤层蛋白的表达水平，发现轻度RS诱导有丝分裂期核膜重组缺陷(NERD)，而Lamin B1和Lamin A/C的水平均降低。通过CUT&Tag鉴定出一个对复制应激敏感的LADs亚群，称为RESSLADs。Lamin A/C的持续磷酸化可能导致RS下RESSLADs-NE相互作用的丧失。很可能纤层蛋白水平降低是由于RS下S期积累的变化。

最后，除了APH处理外，还研究了其他类型复制应激的影响。首先，吡啶斯他汀(PDS)（G-四链体(G4)稳定剂）处理以剂量依赖性方式诱导GFP-BAF焦点的形成。其次，建立了四环素诱导型TetOn-HRas-G12V遗传模型，在RPE-1细胞和IMR-90（人肺上皮）细胞中触发复制应激。多西环素(Dox)诱导后，Lamin B1和Lamin A/C的表达降低，而GFP-BAF水平略有增加，与APH处理相似。相应地，具有GFP-BAF焦点的细胞百分比显著增加，在BAF焦点处观察到Lamin B1耗竭和Lamin A/C富集。因此，NE缺陷似乎是RS的一般性响应。

为了追踪RS诱导NE缺陷的动态过程，首先量化了具有GFP-BAF焦点的细胞百分比。与DMSO处理的对照细胞相比，APH处理的细胞以时间依赖性方式积累GFP-BAF焦点，表明细胞周期进程可能在NE缺陷中发挥作用。通过同步化实验测试这种可能性。应用选择性CDK1抑制剂(CDK1-i) RO-3306将细胞阻滞在G2期。尽管CDK1-i处理单独显示与对照组相同水平的BAF焦点，但APH处理诱导的NE缺陷增加被CDK1-i消除。因此，有丝分裂进入似乎对RS诱导的NE缺陷至关重要。此外，PHA-767491（选择性DDK(Dbf4依赖性激酶)抑制剂(DDK-i)）处理抑制DNA复制起始并导致G1/S积累，也以剂量依赖性方式逆转NE缺陷。一致地，通过内源性BAF染色证实了这两种抑制剂的效果。这些结果表明，RS诱导的NE缺陷与细胞周期进程，特别是有丝分裂进入相关。

为了进一步确认细胞周期与NE缺陷之间的时间关系，构建了表达H2B（组蛋白2B，染色质标记）和GFP-BAF的RPE-1细胞系进行活细胞时间推移成像。正如预期，DMSO处理的细胞在 metaphase 之前或之后均未形成焦点，由于其特征形态，metaphase 被称为"时间0"。然而，APH处理的细胞中的GFP-BAF在 metaphase 之前是扩散的，并在末期快速形成焦点（由箭头指示）。BAF焦点通过小焦点的融合或缺陷的扩大而增加数量和大小。值得注意的是，配对的子代细胞在BAF焦点数量以及BAF积累时间方面表现出异质性。由于末期伴随NE重组，RS诱导的NE缺陷本身是有丝分裂期NE重组缺陷(NERD)的结果，而非间期 de novo NE缺陷。BAF积累平均发生在 metaphase 后约86分钟，并且RS下近50%的有丝分裂事件产生NERD。最后，评估了有丝分裂后的细胞命运。总体而言，APH处理的细胞比DMSO处理的群体表现出更多的异质性。APH处理后，细胞分裂更慢，细胞周期持续时间更长。这可能解释了为什么RS下的BAF焦点积累晚于正常NE重密封的时间（metaphase后约60分钟）。有趣的是，只有少量细胞能够重新密封有缺陷的NE。亲代细胞中BAF焦点越多，子代细胞中观察到的缺陷就越严重。具有不少于3个BAF焦点的细胞倾向于经历细胞周期阻滞或有丝分裂灾难。

由于NE重组在末期高度组织化，通过免疫荧光检查了核心和非核心域蛋白。结果显示，核心蛋白（包括Lamin A/C、Emerin和LAP2β）在APH处理下富集并与GFP-BAF焦点共定位，而非核心蛋白（包括LBR、Nup62和TPR）在GFP-BAF焦点处耗竭。此外，含LEM结构域的蛋白（如LEM1、LAP2α、MAN1、Ankle1和Ankle2）可与BAF相互作用。因此，用RFP或Halo标签标记这些蛋白，并在RPE-1 GFP-BAF细胞中稳定表达。正如预期，它们在RS下均显示与GFP-BAF焦点共定位。尽管RS可诱导有丝分裂错误，包括微核化和超细桥(UFB)形成，但高分辨率成像显示，末期NERD位点远离APH组中的UFB。具有UFBs/NERD的细胞量化显示，RS在末期细胞中诱导~0.62% UFBs和31.34±0.62% NERD。值得注意的是，未观察到UFB与NERD之间的共定位，表明NERD可能不是UFB的直接结果。此外，LEM2（一种跨膜ESCRT适配器）在BAF焦点处积累，并与CHMP7（ESCRT蛋白）共定位，表明ESCRT机制参与NE重密封。总之，这些数据支持RS诱导的NE缺陷是NERD结果的观点。

除了NERD，RS还通过MiDAS或TMEJ通路触发有丝分裂早期DNA损伤和修复合成。这提出了一个问题：这两个过程是否相关，以及有丝分裂DNA损伤对NERD有什么影响？为了解决这个问题，使用siRNA靶向MiDAS相关基因（包括MUS81和POLD3）以及TMEJ因子POLQ来敲低它们的表达，然后研究它们对RS诱导NE缺陷的影响。设计的siRNA有效抑制了这些因子的表达，并减少了通过EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）染色可视化的有丝分裂DNA修复合成，但它们对APH处理下的NE缺陷几乎没有影响。相反，POLQ敲低导致NE缺陷显著增加（~39%），而对照siRNA为~22%。需要注意的是，MUS81耗竭在缺乏RS的情况下增加了NE缺陷率，与其 countering 内在RS和稳定复制叉的作用一致。MUS81耗竭本身导致RS。为了进一步验证这些RNAi结果，使用CRISPR-Cas9与 flanking 起始密码子的双sgRNA敲除POLQ基因。通过PCR和测序确认POLQ-/-克隆的基因型，其mRNA表达被废除。与野生型(WT)相比，APH处理的POLQ-/-细胞显示NE缺陷显著增加。同时，内源性BAF和cGAS-mNG焦点在APH处理后的POLQ-/-细胞中表现出显著增加。这些数据表明，TMEJ通路（而非MUS81-POLD3介导的MiDAS通路）在RS诱导的NERD中发挥重要作用。

接下来，探讨了POLQ-/-中增加的NE缺陷是否 due to 减轻的DNA损伤修复。确实，在RS下，POLQ-/-克隆中检测到更高水平的DNA损伤，而在彗星实验中，DMSO处理下POLQ-/-与WT之间没有差异。为了进一步检查RS诱导的有丝分裂DNA损伤，将细胞通过RO-3306同步在G2/M边界，随后释放到有丝分裂期并进行Edu标记0.5小时，之后收获有丝分裂细胞进行γH2AX或EdU染色。与WT细胞相比，APH处理的POLQ-/-细胞显示更多γH2AX焦点，但来自有丝分裂修复合成的EdU焦点更少。此外，在APH处理下，EdU焦点大多与有丝分裂染色体上的γH2AX焦点共定位。为了研究DNA损伤响应在NERD中的作用，用KU60019（ATM激酶抑制剂(ATM-i)）处理细胞。结果显示，ATM-i（特别是在高浓度下）略微增加DMSO和APH处理细胞中的NE缺陷。在POLQ-/-细胞中观察到类似效果。因此，ATM介导的DNA损伤响应可能不是RS诱导NERD的原因。事实上，ATR被报道在有丝分裂DNA损伤响应中发挥重要作用。同时，值得注意的是，POLQ缺陷细胞显得更加碎片化，具有更多BAF焦点。确实，POLQ耗竭导致APH处理后细胞死亡增加约2.5倍，通过 Annexin V 和 PI（碘化丙啶）染色后的FACS（荧光激活细胞分选）检测到。总之，这些结果确定TMEJ作为RS触发有丝分裂DNA损伤的主要修复通路，减轻轻度RS对NE完整性的不利影响。

RS可能导致CFSs处LADs的丢失。网状核纤层不仅保护NE免受机械应激，还为染色质结合提供支架，与数百个大型基因组区域（称为核纤层相关结构域(LADs)）相互作用。RS是否影响LADs形成？为了解决这个问题，在有无APH处理的RPE-1细胞中对Lamin A/C和Lamin B1进行了 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&Tag)。结果显示，与DMSO处理相比，RS下Lamin A/C和Lamin B1的总染色质结合位点可重复且显著减少。对RS下信号减少的LADs进一步检查，从Lamin A/C中鉴定出485个LADs，从Lamin B1中鉴定出486个LADs。有趣的是，它们中的大多数（355个LADs）在Lamin A/C和Lamin B1之间共享，称为RESSLADs（复制应激敏感LADs）。RESSLADs分布在所有染色体上，但在更接近端粒的染色体末端似乎具有更高密度。这些数据表明，RS下染色质与NE的结合减少。

由于RS（如APH处理）诱导基因组中常见脆弱位点(CFSs)的"表达"和脆弱性，研究了RESSLADs是否位于CFSs中。确实，RPE-1细胞中99个RESSLADs（~28%）位于CFSs中，18个RESSLADs与罕见脆弱位点(RFSs)共定位。然而，一些CFSs（包括FHIT和WWOX）在DMSO和APH之间未显示LADs改变，可能是由于RPE-1的遗传背景，其中CFSs的脆弱性可能与其他细胞系不同。RESSLADs到CFSs的作图显示，信号减少最多的RESSLAD#1位于FRA1A，该位点跨越染色体1上的2.2 Mb区域。确实，另外3个RESSLADs（#29、#33和#200）也定位于FRA1A。相应地，FRA1A显示Lamin A/C和Lamin B1的结合峰分别减少约25%。与在非转化RPE-1细胞系中的结果一致，使用HCT-116细胞系的CUT&Tag实验也显示RS下LADs与Lamin A/C和Lamin B1的结合减少。鉴定出总共382个RESSLADs，其中约24%位于脆弱位点。然而，只有32个RESSLADs（<10%）在RPE-1和HCT-116之间共享。

最后，研究了这种减少的RESSLADs-NE相互作用的潜在后果。为此，检查了RESSLADs中基因的表达。在APH处理下，位于RESSLAD#1（FRA1A）中的基因ACOT7和GPR153以及位于RESSLAD#2（FRA8D）中的基因SLURP1、LYNX1和LY6D的表达显著下调。这种下调可能是由于RS诱导的这些位点DNA损伤。与这一想法一致，有丝分裂细胞中γH2AX的CUT&Tag qPCR显示，APH处理增加了RESSLAD#1和RESSLAD#2中的DNA损伤。此外，Lamin A/C的染色质免疫沉淀(ChIP)-PCR证明，在RS下，POLQ-/-细胞中RESSLADs与NE的结合加剧，表明TMEJ在维持基因组稳定性和染色质-NE相互作用中的重要作用。

在有丝分裂期，纤层蛋白在NE破裂期间发生磷酸化，并在NE重组期间去磷酸化以促进LADs形成。研究人员询问Lamin A/C的磷酸化是否参与RS下RESSLAD与NE相互作用的减少。尽管已报道Lamin A/C上有20多个磷酸化位点，但 focus on 丝氨酸22(pS22)的磷酸化，该位点在有丝分裂期NE重塑中占主导地位。确实，APH处理导致pS22-Lamin A/C增加约5倍，同时降低总Lamin A/C蛋白水平。有趣的是，pS22-Lamin A/C信号在NERD位点高度富集，>72%的BAF焦点含有pS22-Lamin A/C。为了进一步理解这些动力学，使用同步化实验检查了RS下有丝分裂期间pS22-Lamin A/C的变化。细胞用DMSO或APH处理32小时，随后用RO-3306处理另外16小时，然后释放到有丝分裂期。释放前，当细胞处于G2期时，未检测到pS22-Lamin A/C信号。进入有丝分裂后，DMSO处理组显示有丝分裂标记pS10-H3（组蛋白H3丝氨酸10磷酸化）和pS22-Lamin A/C快速且强烈增加，两种信号在60分钟和120分钟之间消失。相反，APH处理组在120分钟后维持高水平的pS22-Lamin A/C，尽管pS10-H3信号消失，与NERD时间相关。APH组中pS10-H3减少可能表明处理细胞的有丝分裂进入延迟。为了克服这个问题，进行了有丝分裂 shake-off 以收获相同数量的有丝分裂细胞。最终，在 individual 时间点，APH组中的pS22-Lamin A/C水平始终高于对照。

为了进一步证明S22-Lamin A/C磷酸化在RS下NERD中的作用，将S22突变引入带有N末端RFP标签的Lamin A。通过瞬时转染在HCT-116细胞中检查突变体。与Lamin A-WT（野生型）相比，磷酸化缺陷型Lamin A-S22A突变体在RS下仍能定位到BAF焦点，但显著降低了具有BAF焦点的细胞百分比。相反，拟磷酸化Lamin A-S22D突变体即使在DMSO处理下也容易导致BAF焦点形成增加，且在APH处理下效果加剧。ATR依赖性Lamin A/C S282磷酸化被报道在间期DNA损伤诱导的NE缺陷中发挥作用。然而，磷酸化缺陷型Lamin A-S282A突变体在DMSO和APH处理下与Lamin A-WT几乎无差异。总之，这些数据证实了pS22-Lamin A/C在RS下NERD和染色质组织中的关键作用。

最后，研究了NERD对临床意义的影响。RS可以激活ATR（共济失调毛细血管扩张突变和Rad3相关蛋白激酶）以维持复制叉稳定性和检查点功能。利用RS下对ATR和DNA损伤响应的依赖已成为抗癌药物发现中诱导合成致死性的策略。在DNA损伤响应领域，合成致死性主要强调染色体不稳定性和DNA损伤的积累，但NE完整性 largely unexplored。尽管VE-821（ATR抑制剂(ATR-i)）处理与单独DMSO处理具有可比效果，但它显著加剧了APH处理诱导的NE缺陷。相应地，ATR-i和APH的协同效应导致细胞活力降低。ATR-i在APH处理细胞中的合成致死性可能部分 due to NE缺陷。这些结果还表明，ATR在抑制有丝分裂DNA损伤和NERD方面比ATM发挥更重要作用。

由于聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂(PARP-i)诱导同源重组(HR)缺陷细胞死亡，检查了用PARP-i处理的HR缺陷型BRCA2-/-细胞中的NE完整性。为此，使用双sgRNA通过CRISPR-Cas9敲除BRCA2基因。通过基因分型确认两个独立的BRCA2-/-克隆，其mRNA表达被废除。与WT细胞相比，两个BRCA2-/-克隆显示增殖降低和微核化比率较高，表明RS水平较高。一致地，BRCA2-/-细胞在DMSO处理下表现出比WT细胞更高的NE缺陷率。当用PARP-i Olaparib处理时，WT细胞没有显著响应，而BRCA2-/-细胞表现出加剧的NE缺陷和降低的活力。这些数据表明，致命性合成相互作用可能导致严重NE缺陷。

有趣的是，DNA聚合酶Polθ和TMEJ通路也与BRCA2显示合成致死性。评估了用Polθ抑制剂(Polθ-i) ART558处理的BRCA2-/-细胞中的NE完整性。与在PARP-i处理下观察到的结果相似，ART558处理的BRCA2-/-细胞（而非WT细胞）显示增加的NE缺陷和降低的细胞活力。值得注意的是，即使非常低浓度(0.1μM)的Polθ-i也导致BRCA2-/-细胞活力显著降低（~60%）。总之，这些结果表明，NERD和随后的NE功能障碍可能是合成致死条件下的 general 细胞响应。

最后，特别检查了细胞代谢在具有RS诱导NE缺陷的细胞中的后果。结果显示，APH处理组显示线粒体延长。在同一群体中，具有BAF焦点的细胞比没有BAF焦点的细胞具有显著更长的线粒体。此外，自噬流也被RS改变，因为GFP-LC3焦点的数量增加了2倍以上。因此，RS诱导的NE缺陷伴随代谢变化，如线粒体功能障碍和自噬改变，突出了RS对细胞功能的复杂和多方面影响。

RS研究主要集中于DNA损伤响应和基因组不稳定性，对其对细胞结构（如核膜）影响的探索有限。本研究使用多种NE完整性报告系统建立了RS下基因组不稳定性与NE缺陷之间的联系。不同报告系统中NE缺陷的基线 vary，反映了其固有噪声和局限性。值得注意的是，内源性BAF染色和RFP-NLS GFP-BAF双报告系统均显示约1% NE缺陷，这与报道的具有内源性BAF染色的大型数据集一致。尽管如此，本研究中使用的所有报告系统都能检测到RS下NE缺陷的显著增加。需要注意的是，RS诱导的有丝分裂期NERD似乎与间期 prolonged DNA损伤触发的NE破裂 quite different。此外，RS可诱导有丝分裂DNA损伤并导致Lamin A/C持续磷酸化，从而引起NERD。DNA Polθ/TMEJ通过修复有丝分裂DNA损伤抑制NERD。相反，Polθ缺陷加剧NERD。

作为RS的结果，复制 machinery 的有丝分裂进入导致复制体 disassembly 和 under-replicated DNA 暴露于核酸酶， resulting in DSBs。有丝分裂期间DSBs的修复具有挑战性，因为包括HR和NHEJ在内的经典DSB修复通路在有丝分裂期 largely inactive。先前研究表明，MiDAS有效修复RS诱导的有丝分裂DNA损伤。尽管MUS81和POLD3的耗竭减少而非废除有丝分裂DNA合成，但它们不影响RS下的NERD。引人注目的是，发现Polθ/TMEJ在减少RS诱导的有丝分裂DNA损伤和NERD方面发挥关键作用。与发现一致，最近一项研究表明，TMEJ（而非MiDAS）介导有丝分裂期CFSs的修复。对由MUS81-POLD3介导的MiDAS和TMEJ distinct roles 的一种可能解释是时间分辨率：MiDAS可能将复制延长到前期，而TMEJ修复后期直到NE重组的有丝分裂DNA损伤。这表明MiDAS通路和TMEJ可能靶向不同类型的DNA底物或基因组区域。此外，不能排除Polθ在维持NE完整性或调节有丝分裂期NE重组中发挥直接作用的可能性，这仍有待研究。此外，NERD可能涉及微同源介导末端连接通路中调节NE重组的其他因子。

在前期NE破裂期间，内核膜蛋白（包括Lamin A/C）经历渐进式磷酸化。CDK1/Cyclin B对Lamin A/C的S22和S392磷酸化导致Lamin A/C解聚和染色质结合释放。本研究中鉴定的NERD位点持续pS22-Lamin A/C暗示Lamin A/C在NERD期间组织NE结构和LADs-NE相互作用中的功能缺陷。未来研究将 address 有丝分裂DSBs如何调节Lamin A/C磷酸化，以及这种去磷酸化失败是否 due to NERD期间持续激酶激活或磷酸酶抑制。值得注意的是，Lamin A/C也可以在 prolonged DNA损伤期间以ATR依赖性方式磷酸化，或在微核中磷酸化。然而，这些事件被认为发生在间期，与RS诱导的有丝