自驱动节律性光动力系统：利用发光细菌实现肿瘤长效治疗的新策略

本研究针对传统光动力疗法(PDT)依赖外部设备、患者活动受限的难题，开发了一种自驱动节律性光动力系统(Sd-PDT)。通过将发光细菌与光敏剂NR封装于海藻酸微胶囊(PB@MCs)，利用肿瘤微环境营养持续产生生物发光，实现50小时长效活性氧(ROS)生成。单次注射即可消除>300 mm3黑色素瘤和肝癌，并激活抗肿瘤免疫，为深部肿瘤治疗提供新方案。

　　

在癌症治疗领域，光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)作为一种 clinically validated treatment（临床验证的治疗方法），已被广泛应用于食管、胃、肺和宫颈等浅表器官癌症的治疗。然而，传统PDT面临着一个根本性挑战：它需要借助光纤将光引导至体内病灶，进行短期高强度光照射（强度>100 mW/cm2，持续数十分钟），这种操作不仅可能导致组织热损伤，还严重限制了患者的行动自由。更棘手的是，光照不足无法产生足够的抗肿瘤效果，而过度照射又会造成组织损伤，这种两难境地一直困扰着研究人员。

近年来出现的节律性光动力疗法(metronomic Photodynamic Therapy, mPDT)似乎带来了转机。这种疗法采用长时间低强度光照（强度<10 mW/cm2，持续数小时至数十小时），显著降低了热损伤风险的同时能有效杀灭癌细胞。但现有的mPDT仍然需要连续给药和依靠电池供电的植入式设备，这种外部设备依赖性问题限制了其临床应用。目前尚无能够完全脱离外部支持设备的mPDT模式，这凸显了开发不依赖外部能源的体内光源的迫切需求。

正是在这样的背景下，浙江大学医学院附属第二医院的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究，他们从深海鮟鱇鱼的发光器官中获得灵感，开发了一种全新的自驱动节律性光动力系统(Self-driven metronomic photodynamic system, Sd-PDT)。这项研究巧妙地将生物发光细菌与光敏剂相结合，创造了一种能够在不依赖外部能源的情况下持续发光的新型治疗系统。

研究人员主要运用了以下关键技术：首先筛选适配生理条件的发光菌株（哈维氏弧菌Vibrio harveyi BB170），通过静电滴注系统制备细菌封装的海藻酸钙微胶囊（150μm），并采用聚赖氨酸(PLL)涂层防止细菌逃逸；接着通过化学接枝将NHS-Neutral Red(NHS-NR)光敏剂修饰到微胶囊表面；利用Transwell共培养系统评估体外抗肿瘤效果；通过DCFH-DA探针和组织羟自由基检测试剂盒测定活性氧水平；采用非靶向代谢组学分析肿瘤代谢变化；使用流式细胞术检测细胞凋亡和免疫细胞活化；最后在黑色素瘤小鼠模型和兔VX2肝癌模型（肿瘤组织来源的移植模型）中进行体内疗效验证。

Engineering and characterisation of PB@MCs

研究人员首先构建了预期的PB@MCs，将生物发光细菌封装在微胶囊中，并在微胶囊表面化学接枝光敏剂分子。他们筛选了三种发光菌株，最终选择能够在37℃生理条件下保持标准生长和发光输出的哈维氏弧菌VH.BB170。对于光敏化作用，研究人员选择了NHS-Neutral Red(NHS-NR)，因为VH.BB170菌株在400-600 nm范围内发出的强生物发光与NHS-NR的吸收范围完美匹配。

通过静电吸引使用静电液滴生成系统将生物发光细菌封装在微胶囊中，微胶囊的形态和尺寸控制在150μm以内，这个尺寸特别适合用于内部肿瘤的生物相容性Sd-PDT工程。这些PLL-B@MCs在37℃的2216E培养基中进一步培养，使细菌进入平台期。最后，PLL与NHS-NR之间形成共价酰胺键，从而将NR高效缀合到微胶囊上，形成PB@MCs。

共聚焦激光扫描显微镜检查显示，虽然空微胶囊没有显示生物发光，但含有生物发光细菌的微球（B@MCs和PB@MCs）发出鲜艳的蓝光，表明微胶囊表面的PS涂层不影响细菌的发光能力。研究人员评估了PB@MCs在生理溶液和各种培养基配方中的长期生物发光能力，发现当生物发光减弱时，立即补充新鲜培养基能够恢复PB@MCs的光发射，在透明瓶中维持32小时。计算表明，PB@MCs可以在DMEM培养基中以1-5 mW/cm2的功率密度发射生物发光长达50小时，这适合mPDT光照射剂量，并显著超过目前所有化学驱动PDT的持续时间。

Anti-tumour cells and ROS generation test of PB@MCs

研究人员探索了使用PB@MCs进行Sd-PDT对癌细胞的疗效。研究评估了对四种不同癌细胞系的影响，包括两种肝细胞系（Hep3B和VX2）和两种黑色素瘤细胞系（A375和B16）。使用24孔Transwell和6孔Transwell设置防止PB@MCs与癌细胞直接物理接触，便于评估Sd-PDT效果。

细胞活力评估显示，在所有细胞系中，PB@MC组细胞死亡率显著增加，表明具有强大的细胞毒性作用。相反，用只含细菌或PS的B@MCs和P@MCs处理的细胞保持超过90%的细胞活力，表明它们的毒性较低。细胞代谢功能分析结果与LIVE/DEAD染色结果一致，证明PB@MC组在所有测试的癌细胞系中都具有显著的细胞毒性作用。

为了验证这些抗肿瘤效果主要归因于ROS production（活性氧产生），研究人员分析了PB@MCs在体外（生理溶液）和体内（肿瘤环境）的ROS生成能力。体外测试显示，与用B@MCs处理的细胞相比，用PB@MCs处理的细胞观察到强烈的荧光，表明更多的ROS生成。体内实验表明，用PB@MCs处理的小鼠表现出显著更高的荧光强度，证明增强了·OH生成并证实了体外发现。

研究人员持续监测ROS生成约50小时，比较了Sd-PDT与传统PDT（外部LED在300 mW/cm2照射NR，每次1小时）的持续时间和强度。LED组在1小时照射期间表现出显著的ROS荧光信号增加，表明初始ROS生成快速而强烈，但照射结束后ROS production立即停止。相反，PB@MC组在整个治疗期间（约50小时）表现出持续的ROS生成，尽管初始荧光强度低于LED组。这些结果证实了Sd-PDT系统在单次治疗中的持续ROS生成能力，反映了它们在肿瘤环境中的持续有效性。

Metabolism analysis of tumours after PB@MCs treatment

除了ROS的影响外，研究人员还进行了代谢组学分析以阐明PB@MCs的抗肿瘤机制。使用非靶向代谢组学比较PB@MC治疗后肿瘤微环境中各种代谢物的水平。主成分分析突出了不同治疗组的代谢物分布谱。PB@MCs诱导了代谢谱的显著改变，使这些谱与其他组明显区分，表明PB@MCs可能诱导了代谢重组。

火山图分析识别出PB@MC组与对照组相比有90种显著下调和50种上调成分。聚类分析证明PB@MC处理组与其他组之间存在显著代谢物表达差异。PB@MCs显著降低了参与葡萄糖和脂质代谢等关键途径的代谢物，包括葡萄糖6-磷酸。这些代谢物的减少表明PB@MC治疗减少了肿瘤细胞对碳源的利用以及NADPH和核酸的合成，这破坏了肿瘤细胞中的氧化还原平衡，导致高水平的ROS并阻碍核苷酸和甘油酯等大分子的合成，从而干扰肿瘤细胞增殖。

途径富集分析显示脂质和氨基酸代谢途径强烈集中。进一步分析发现，与谷胱甘肽代谢密切相关的代谢途径，包括半胱氨酸和蛋氨酸代谢、辅因子生物合成、ABC转运蛋白和甲状腺激素合成，在PB@MC治疗后显著抑制，有助于增加ROS应激和抗肿瘤效果。此外，磷脂生物合成途径，包括甘油酯和鞘脂代谢途径，显著下调。由于甘油酯和鞘脂对维持细胞膜完整性至关重要，它们的下调限制了肿瘤细胞扩张和修复所需的基本膜成分的供应，从而增强了ROS介导的细胞毒性。

Immunology analysis of PB@MCs in tumour

PB@MC诱导的Sd-PDT可在癌细胞中引起有效的immunogenic cell death(ICD，免疫原性细胞死亡)，促进damage-associated molecular patterns(DAMPs，损伤相关分子模式)的表达。这个过程增强了DCs（树突状细胞）在肿瘤微环境中的成熟和招募。随后，成熟DCs激活cytotoxic T lymphocytes（细胞毒性T淋巴细胞），从而加强抗肿瘤免疫反应。

在关键的ICD的DAMPs中，calreticulin(CRT，钙网蛋白)对DC激活特别重要。用PB@MCs、B@MCs、PS和PS-LED处理的B16细胞显示CRT从内质网转移到细胞膜，表达水平分别比对照组高6倍、1.35倍、1.85倍和1.8倍。在VX2细胞中也观察到类似模式。用酶联免疫吸附测定法测量小鼠血清中干扰素-γ(IFN-γ)的浓度，PB@MCs治疗导致IFN-γ水平显著增加，表明显著的免疫激活。

此外，DCs的成熟，以CD80和CD86表达增加为标志，通过流式细胞术进行量化。与对照组相比，PB@MC治疗组中成熟DCs的比例在体外从25%显著增加到60%。这些结果表明PB@MCs有效改变了免疫微环境以抑制肿瘤生长。体内实验进一步探索了这种免疫疗法的效果。使用流式细胞术评估T淋巴细胞在肿瘤内的浸润情况。PB@MC组显示肿瘤内T细胞的存在显著增加，特别是CD8 T细胞，在PB@MCs治疗的肿瘤中达到总CD3+细胞的约33%，显著高于其他组。因此，CD8+/CD4+比率增加。

Photodynamic therapeutic effects of PB@MC treatment in vivo

为了验证PB@MC治疗的体内效果，研究人员通过皮下引入B16细胞创建了黑色素瘤同基因肿瘤模型。当肿瘤生长到约300 mm3时（约18天），将小鼠随机分配到五个不同的治疗组：不治疗（vehicle control）、PB@MCs、B@MCs、PS治疗或PS与LED照射（60分钟，300 mW/cm2）。

观察显示，未治疗组肿瘤快速扩大，而PS和PS-LED治疗对黑色素瘤进展的影响可忽略不计。相反，B@MC组从第4-6天开始肿瘤生长恢复。显著的是，体积指标证实PB@MCs提供了最显著的抗肿瘤反应，导致肿瘤完全消除。在耐受性方面，用PB@MCs治疗的小鼠没有显示显著的体重波动（约2克）。生存分析表明，除用PB@MCs治疗的小鼠外，所有小鼠在14天内死亡或濒死。相比之下，PB@MCs不仅在4天内完全治疗了病症，而且显著延长生存期至两个月，十只小鼠中有九只存活超过60天。

Effects of PB@MC implants on hepatocarcinoma

研究人员进一步通过将PB@MCs直接植入兔肝脏中研究了Sd-PDT对肝细胞癌的体内效果。基于概述的治疗方案，患有肝细胞癌的兔子接受单次肿瘤内注射PB@MCs，并监测70天。在此期间使用CT成像监测肿瘤生长进展。

考虑到肝细胞癌容易转移到肺部，研究人员通过CT成像评估了肺部。到第14天，未治疗兔子的肺部明显转移活性；到第28天观察到广泛的肿瘤灶形成。相反，PB@MC治疗组在第70天没有检测到肺转移。奥沙利铂（一种典型的抗肿瘤药物）被用作临床药物对照。虽然奥沙利铂治疗的兔子肿瘤体积到第14天增加到3.8 cm3，到第28天增加到11.4 cm3，但PB@MCs的给药阻止了肿瘤扩张，肿瘤尺寸到第14天减小到难以辨别的小囊状结构。

随后的苏木精和伊红(H&E)染色证实存在肿胀的肝细胞、坏死肝细胞和外围纤维化组织，而外部存在正常肝细胞。使用Kaplan-Meier图的生存分析证明PB@MC治疗的兔子相比对照组有显著的生存益处。不同组肿瘤组织的CD3+免疫荧光和TUNEL染色显示PB@MC治疗诱导了强大的抗肿瘤免疫力。进行H&E染色以评估肝细胞癌肿瘤及其肺转移的组织病理学特征。这些结果表明PB@MC治疗显著遏制了肿瘤生长，有效抑制肿瘤转移和复发，并提高了肝细胞癌兔子的存活率。

这项研究的成功开发为肿瘤生物学研究和癌症治疗提供了重要潜力。这种方法可能成为治疗各种癌症类型和肿瘤大小的有前景的通用治疗策略。通过巧妙结合生物发光细菌和光敏剂增强的mPDT与细菌的免疫刺激能力，该研究团队开发了一种能够同时抑制肿瘤生长和防止肿瘤复发的创新策略，通过激活先天性和适应性免疫反应。研究结果突出了战略整合生物发光细菌与mPDT和免疫治疗的实用性，利用生物发光细菌激活的PS作为ROS的持久来源用于持续mPDT激活，以及作为放大PDT诱导ICD的有影响力的免疫刺激剂。

这种自驱动节律性光动力系统代表了癌症治疗领域的重要突破，特别是对于深部肿瘤和传统光动力疗法难以触及的病灶。该系统不仅解决了外部设备依赖性问题，还通过激活免疫系统实现了长期抗肿瘤效果，为临床癌症治疗提供了新的思路和方向。随着进一步的研究和开发，这种基于生物发光细菌的自驱动治疗系统有望在未来成为癌症治疗的重要手段之一。