核内膜蛋白LEMD3通过锚定异染色质维持血管平滑肌细胞收缩表型的3D基因组机制

本研究揭示了核内膜蛋白LEMD3通过结合组蛋白修饰阅读器CBX3，锚定H3K9me2/3修饰的异染色质至核周区域，从而维持血管平滑肌细胞（VSMC）收缩表型的新机制。通过基因组尺度CRISPR筛选、多组学分析和三维基因组建模，发现Lemd3缺失导致A/B区室边界处拓扑关联结构域（TAD）间相互作用增强，染色质可及性降低，最终抑制收缩相关基因表达。该研究为血管疾病治疗提供了新的潜在靶点。

　　

在血管生物学领域，维持血管平滑肌细胞（VSMC）的收缩表型对血管稳态至关重要。正常情况下，VSMC高度表达收缩标志物如平滑肌肌球蛋白重链11（MYH11）、钙调蛋白（calponin）、转胶蛋白（TAGLN/ SM22α）和α-平滑肌肌动蛋白（ACTA2），以维持血管结构和功能。然而，在血管损伤或疾病状态下，VSMC会发生表型转换，失去收缩特性，获得迁移和增殖能力，导致动脉粥样硬化、血管钙化、内膜增生和动脉瘤等病理变化。尽管转录因子和表观遗传调控（如非编码RNA、DNA甲基化和组蛋白修饰）已被证明参与这一过程，但三维（3D）染色质结构在VSMC身份维持中的作用仍不清楚。

为了深入探索这一问题，研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们通过基因组规模的CRISPR筛选技术，结合多组学分析和先进的3D基因组建模方法，揭示了内核膜蛋白LEMD3在维持VSMC收缩表型中的关键作用。研究不仅发现了LEMD3与异染色质标记阅读器CBX3的直接相互作用，还阐明了其通过调控3D染色质结构影响基因表达的分子机制。

研究采用了多种关键技术方法：首先利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建了ACTA2-P2A-EGFP报告基因的MOVAS细胞系，用于全基因组CRISPR筛选；通过蛋白质相互作用组分析（Co-IP和LC-MS/MS）鉴定LEMD3的结合蛋白；采用Hi-C技术分析3D染色质结构变化；运用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）评估组蛋白修饰分布；通过ATAC-seq检测染色质可及性变化；并利用RNA-seq分析转录组改变。此外，研究还建立了平滑肌细胞特异性Lemd3基因敲除小鼠模型，用于体内功能验证。

研究结果

全基因组CRISPR筛选鉴定LEMD3是维持血管平滑肌细胞收缩表型的关键因子

研究人员首先设计了一种基于EGFP报告基因的基因组规模CRISPR筛选策略。通过将P2A-EGFP序列敲入小鼠VSMC细胞系MOVAS中的ACTA2基因位点，建立了能够实时监测VSMC表型状态的报告细胞系。经过两轮流式分选富集EGFP低表达细胞群体，筛选出109个潜在调控基因。其中Lemd3作为未知功能基因之一，其敲低显著降低了VSMC收缩标志物（Acta2、Cnn1、Tagln和Myh11）的表达。

LEMD3在体外维持血管平滑肌细胞的收缩表型

免疫荧光和免疫组化分析显示LEMD3主要定位于VSMC细胞核内及核膜区域。其表达水平与VSMC收缩表型呈正相关：血清饥饿和雷帕霉素处理诱导收缩表型时LEMD3表达上调，而PDGF-BB诱导去分化时其表达下调。在大鼠和人类VSMC中，Lemd3敲低显著抑制了血清饥饿或雷帕霉素诱导的收缩基因表达上调，并导致细胞形态由细长收缩型变为多角合成型，细胞收缩能力降低。值得注意的是，Lemd3敲低促进了VSMC增殖，但不影响细胞迁移能力。

Lemd3缺失导致体内血管平滑肌细胞收缩表型丧失

研究人员构建了他莫昔芬诱导的平滑肌细胞特异性Lemd3敲除小鼠（Lemd3^SMKO）。与对照组相比，Lemd3^SMKO小鼠主动脉中收缩标志物ACTA2、CNN1和TAGLN表达显著降低，主动脉环和肠系膜阻力动脉对去氧肾上腺素的收缩反应减弱。在颈动脉导丝损伤模型中，Lemd3缺失显著加剧了内膜增生，损伤后28天的新内膜面积和内膜/中膜比率明显增加，血管壁细胞增殖增强。

LEMD3与CBX3相互作用

蛋白质相互作用组分析鉴定出67个LEMD3潜在结合蛋白，包括SMAD2/3和CBX3。Co-IP实验证实了LEMD3与CBX3在HEK293T细胞、大鼠VSMC和小鼠主动脉组织中的内源性相互作用。结构域映射分析表明LEMD通过其RNA识别基序（RRM）结构域与CBX3结合。功能实验显示，不能结合CBX3的ARRM突变体无法逆转PDGF-BB诱导的VSMC表型转换，而RRM结构域过表达则阻断内源性LEMD3-CBX3相互作用并降低收缩蛋白水平。同时敲低实验证明LEMD3和CBX3在维持VSMC收缩表型中存在相互依赖关系。

LEMD3锚定异染色质于核周并维持3D染色质结构

免疫荧光显示Lemd3敲低导致异染色质标记H3K9me3从核周向核内重新分布，但总H3K9me3水平未发生变化。基于Hi-C数据的3D聚合物模型显示，Lemd3敲低细胞的核周B区室（异染色质富集区）向核内偏移。电子显微镜观察进一步证实Lemd3^SMKO小鼠主动脉平滑肌细胞中核周异染色质减少。Cbx3敲低或RRM结构域过表达（阻断LEMD3-CBX3相互作用）均重现了H3K9me3修饰的异染色质核内重新分布表型。

Lemd3缺失增加A/B区室边界处的TAD间相互作用并降低收缩相关基因表达

Hi-C分析发现Lemd3敲低并不影响整体的A/B区室组织和TAD结构，但显著改变了TAD间相互作用模式。特别值得注意的是，A/B区室边界处的相邻TAD间相互作用特异性增强。多组学整合分析（ATAC-seq和RNA-seq）显示，Lemd3敲低导致143个基因（包括Acta2、Cnn1、Tagln、Myh11和Col4a1等收缩相关基因）的染色质可及性降低和mRNA表达下调。这些基因的启动子区域富含MEF2A/C/D、SRF和TEAD3/4等VSMC身份关键转录因子的结合 motif。其中62个位于A-B边界TAD中的基因显著富集于肌肉细胞分化和平滑肌收缩通路。

研究人员进一步发现，在人类冠状动脉平滑肌细胞中，LEMD3调控的同源基因同样位于A/B区室边界TAD中，且其中COL4A1和MYH11等基因所在基因组区域存在与冠状动脉疾病（CAD）相关的单核苷酸多态性（SNP），提示LEMD3调控的3D基因组紊乱可能与人类血管疾病发病机制相关。

研究结论与意义

本研究系统阐明了内核膜蛋白LEMD3通过相互作用CBX3锚定异染色质至核周区域，维持3D染色质结构，从而保障VSMC收缩表型的关键机制。研究发现：

1. 1.
   LEMD3表达与VSMC收缩表型正相关，其缺失导致收缩标志物表达降低和血管功能异常
2. 2.
   LEMD3通过RRM结构域与异染色质阅读器CBX3直接结合，介导异染色质核周锚定
3. 3.
   Lemd3缺失引起异染色质核内重新分布和3D染色质结构改变，特别是A/B区室边界处TAD间相互作用增强
4. 4.
   3D基因组紊乱导致收缩相关基因染色质可及性降低和表达抑制，最终引发VSMC表型转换
5. 5.
   LEMD3调控的基因中包含与人类冠状动脉疾病相关的遗传位点，提示其临床意义

该研究不仅首次揭示了3D基因组架构在VSMC身份维持和血管稳态中的关键作用，还为心血管疾病的治疗提供了新的潜在靶点。LEMD3-CBX3相互作用界面以及其调控的3D基因组动态变化可能成为未来治疗血管增殖性疾病的新策略。