全光学电压成像揭示清醒小鼠小脑突触可塑性新机制

本刊推荐：为直接测量活体大脑中特定突触的效能和可塑性规则，研究人员开发了结合基因编码电压指示剂JEDI-2Psub、双光子成像、光遗传学和感觉刺激的全光学方法，成功在清醒小鼠小脑浦肯野细胞树突中实现了突触后电压信号的长时程高保真读取，揭示了颗粒细胞激活与爬行纤维输入配对可触发抑制性突触的长时程增强（LTP），为在行为动物中研究记忆存储提供了创新性研究范式。

　　

大脑如何存储记忆？这个问题的答案深藏在神经元之间数万亿个突触连接的微妙变化中。特别是小脑，这个负责运动学习和协调的重要脑区，其突触可塑性机制一直是神经科学家关注的焦点。然而，在活体大脑中直接测量突触效能并定义突触可塑性诱导规则，长期以来面临着巨大的技术挑战。传统的细胞内记录方法通常短暂、费力且成功率低，而常用的双光子钙成像只能间接反映动作电位和突触激活情况，无法直接捕捉关键的突触后电压信号。

近日发表在《Nature Communications》上的研究突破性地开发了一种全光学方法，能够在清醒、行为小鼠中探测特定小脑突触的可塑性。这项研究结合了经过优化的基因编码电压指示剂(GEVI)、双光子成像、光遗传学和感觉刺激技术，实现了对 cerebellar Purkinje cells(PCs)树突突触后电压信号的长时程、高保真读取。

研究团队运用的关键技术方法包括：1）开发新型电压指示剂JEDI-2P_sub，通过色氨酸插入提高静息膜电位附近的灵敏度；2）在Math1-Cre转基因小鼠小脑蚓部V/VI小叶共注射AAV病毒，分别用CaMKII启动子在浦肯野细胞表达JEDI-2P_sub，用Cre依赖性载体在颗粒细胞表达红色移行兴奋性视蛋白ChRmine；3）使用共振扫描双光子显微镜在440Hz下对清醒头部固定小鼠进行成像；4）结合光遗传学激活颗粒细胞输入和感觉刺激激活爬行纤维输入的配对协议。

双光子电压成像和光遗传学揭示小脑树突膜电位动力学

研究团队首先对JEDI-2P进行改造，通过在与电压感应结构域之间插入色氨酸，开发出JEDI-2P_sub。这种新型指示剂对单峰电压响应增加了34.1±6.8%，更重要的是将电压敏感性向更负的膜电位移动，对静息膜电位附近的电压变化响应提高了3.5倍，非常适合报告突触后电位。在体实验中，他们在浦肯野细胞树突中观察到了大的自发电压瞬变(ΔF/F₀ = -31.2±4.4%)，这些事件具有快速去极化和缓慢复极化的特征，与爬行纤维驱动的复杂锋电位特性一致。感觉刺激可诱发多样化的电压信号，而光遗传学激活颗粒细胞通常引起浦肯野细胞的梯度超极化，这些反应可被gabazine抑制，证实是通过GABAA受体介导的feed-forward IPSPs。

树突反应的时空分析区分突触驱动和再生性Ca2?事件

研究发现相邻浦肯野细胞树突中经常观察到同步的复杂锋电位信号，反映了小脑皮层的解剖和功能"微区"。这些同步事件非常精确，平均交叉相关图峰宽为6.4ms。有趣的是，无论是自发的还是感觉诱发的复杂锋电位信号幅度在相邻细胞间均无显著相关性，表明这些信号在相邻细胞中是独立调节的。相比之下，感觉刺激和光遗传学刺激颗粒细胞引发的IPSP幅度在相邻细胞间高度相关(R=0.807)。研究还将树突arbor分割成~5μm段，发现复杂锋电位信号在树突树上分布相对均匀(CV=0.095±0.043)，而IPSPs则呈现更异质的空间分布(CV=0.130±0.061)，反映了抑制性突触输入的离散和非均匀激活。

在体可塑性诱导引发LTP并使PC树突活动正常化

研究团队利用光遗传学招募颗粒细胞与感觉诱发的爬行纤维输入协同激活——这是小脑皮层可塑性诱导的经典配对协议，并通过电压成像光学监测浦肯野细胞树突抑制性输入的突触效能。采用时间依赖的诱导协议（爬行纤维输入后150ms激活颗粒细胞，1Hz重复300次）导致了IPSP信号的稳健长时程增强(LTP)，这种增强效果持续整个实验期间（配对后40分钟）。对照组中，省略配对程序未观察到增强效应，逆转颗粒细胞和爬行纤维刺激顺序也不会产生显著增强。进一步分析发现，基线IPSP较小的浦肯野细胞表现出更大的LTP，且相邻浦肯野细胞间的LTP幅度高度相关(R=0.611)。值得注意的是，LTP伴随着树突树上IPSP信号变异性的减少，即使树突树的空间分布保持不变。

研究结论表明，这种结合光遗传学与双光子电压成像的方法，使用针对检测阈下事件优化的基因编码电压传感器，能够在清醒行为小鼠中实现单个树突突触可塑性的光学控制和读取。该方法允许在树突树内和相邻神经元间比较阈下和阈上信号，实现单细胞和神经元网络中突触可塑性的测量。实验揭示了一种由颗粒细胞和爬行纤维输入联合激活介导的抑制性可塑性形式，这增加了对抑制性突触作为可塑性重要基质的认识。这种LTP形式可能起到平衡兴奋性突触LTP的作用，鉴于抑制也调节爬行纤维钙信号，它还可能限制未来由爬行纤维触发的可塑性。

这项研究为光学研究完整大脑中的突触可塑性提供了蓝图，利用了双光子成像的分辨率和灵敏度以及电压成像的速度和直接性。该方法与最近的高速显微镜进展高度兼容。最终，通过进一步完善这种方法来监测整个树突树的突触效能，在单个树突棘和行为任务期间，将个体突触的可塑性与学习联系起来这一期待已久的目标可能终于触手可及。