静脉注射iRGD引导的红细胞膜伪装乳酸乳球菌重塑非小细胞肺癌冷肿瘤并增强PD-1阻断治疗

本研究发现，通过红细胞膜（RBC）伪装和肿瘤穿透肽iRGD修饰的工程化乳酸乳球菌（iRGD-mRBC@FOLactis），可系统性地靶向非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤并重塑免疫微环境。该"活体药物"能高效分泌Flt3L和OX40L，显著增强树突状细胞（DC）浸润与T细胞活化，将免疫"冷"肿瘤转化为"热"肿瘤，并与抗PD-1抗体产生协同效应，为克服免疫检查点阻断（ICB）耐药提供了创新策略。

　　

引言

非小细胞肺癌（NSCLC）作为全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其治疗面临重大挑战。虽然针对程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1（PD-1/PD-L1）轴的免疫检查点阻断（ICB）疗法已重塑NSCLC治疗格局，但仅有约30%患者能获得持久临床获益，主要耐药机制包括肿瘤免疫原性弱、抗原呈递受损以及效应T细胞向肿瘤微环境（TME）浸润有限。因此，亟需开发能重编程免疫抑制性TME、促进T细胞介导肿瘤清除的新策略。

原位肿瘤疫苗接种通过瘤内递送免疫刺激剂代表了一种重要方法，可增强抗原呈递并激活肿瘤浸润淋巴细胞。活细菌疗法是一类有前景的原位疫苗，受益于其固有肿瘤归巢能力、病原体相关分子模式（PAMPs）和遗传可操作性。研究团队先前开发了一种工程化益生菌乳酸乳球菌株（"FOLactis"），能稳定共表达两种强效免疫刺激分子：Fms样酪氨酸激酶配体（Flt3L）和OX40配体（OX40L）。瘤内注射FOLactis可招募树突状细胞（DCs），增强引流淋巴结（TDLNs）中的抗原交叉呈递，激活NK细胞和效应T细胞，并抑制调节性T细胞（Tregs），在低浸润或PD-1/PD-L1耐药肿瘤模型中产生强效全身抗肿瘤活性，与PD-1/PD-L1抑制剂具有协同作用。

为克服瘤内注射的挑战（如高间质压力和致密基质），团队将FOLactis封装在热敏性Poloxamer 407水凝胶中。这种缓释系统改善了肿瘤滞留，增强了DC活化，并扩大了记忆T细胞形成，从而放大了全身抗肿瘤免疫。在恶性胸腔积液（MPE）模型中，优化的胸膜内FOLactis递送通过激活CD103⁺ DCs和效应T细胞，降低了胸腔肿瘤负荷并增强了肿瘤特异性免疫。为克服个性化新抗原肽疫苗的限制，团队进一步利用Plug-and-Display技术开发了Ag-FOLactis，实现了细菌表面快速新抗原肽呈递，在皮下和转移肿瘤模型中均引发强效新抗原特异性T细胞反应并伴随表位扩散。

然而，瘤内或淋巴内注射限制了其仅适用于可触及的病灶，凸显了对全身递送平台以治疗播散性或深部肿瘤的需求。先前的全身细菌疗法面临快速清除和肿瘤靶向差的问题。为实现系统性递送，团队用红细胞（RBC）膜伪装FOLactis，其展示的"自我"标记物如CD47可抑制巨噬细胞摄取。RBC膜涂层已知能延长纳米颗粒循环时间，也将细菌半衰期延长14倍，肿瘤积累增加42倍，同时减少全身炎症。基于这些发现，团队通过膜挤压制备了RBC包被的FOLactis（mRBC@FOLactis），假设这种仿生伪装能实现免疫逃避和高效肿瘤递送。

为进一步增强肿瘤归巢和穿透，团队用肿瘤穿透环肽iRGD（CRGDKGPDC）功能化mRBC@FOLactis。iRGD结合肿瘤血管上的α_vβ₃/β₅整合素，并在蛋白酶解切割后与neuropilin-1相互作用触发深层组织穿透。通过脂质插入将iRGD掺入RBC膜，产生了iRGD-mRBC@FOLactis，这是一种具有卓越肿瘤靶向能力的仿生细菌平台。

结果

mRBC@FOLactis的制备与表征

通过从小鼠分离红细胞、提取其膜并通过机械挤压与FOLactis融合制备工程化mRBC@FOLactis。流式细胞术评估显示，增加膜输入量逐步增强膜结合，在32 mg时达到饱和，确定为最佳剂量。流式细胞术证实了FOLactis的成功RBC膜包被。抗CD47染色显示CD47⁺细菌事件呈剂量依赖性增加，在约32 μg mL^?1膜蛋白时达到平台期。共聚焦荧光显微镜显示绿色（GFP表达的FOLactis）和红色（DiI标记的RBC膜）荧光明显共定位，表明均匀的膜覆盖。透射电镜（TEM）显示每个细菌被连续、均匀且完整的膜层完全包裹。动态光散射（DLS）显示mRBC@FOLactis的流体动力学直径随时间稳定，表明优异的胶体稳定性。Zeta电位分析显示随着膜输入量增加，表面负电荷逐渐增加，最终接近天然RBCs。菌落形成试验证实膜包被未损害细菌活力或生长。

为评估RBC膜伪装对免疫逃避的功能影响，进行了体外吞噬试验。与未包被FOLactis相比，暴露于mRBC@FOLactis的细胞显示显著更弱的GFP信号，表明RBC膜伪装有效减少了免疫细胞对细菌的摄取。

mRBC@FOLactis的体内评价：抗肿瘤功效与安全性

在皮下LLC-Luc模型中的研究表明，mRBC@FOLactis治疗组在整个观察期间显示显著更低的生物发光，表明有效抑制肿瘤进展。研究终点离体肿瘤重量显示，mRBC@FOLactis组的肿瘤质量显著低于对照组。组织病理学分析显示，mRBC@FOLactis治疗的肿瘤组织呈现松散结构，伴有广泛坏死和明显炎症浸润，而其他组肿瘤保持致密细胞结构且坏死极少。Ki67免疫组化显示mRBC@FOLactis组增殖细胞比例显著降低。

进一步的安全性评估通过常规血液测试和血清生化进行。mRBC@FOLactis组显示显著更低的白细胞计数、血小板计数和AST水平，而其他指标包括RBC计数、平均红细胞体积（MCV）、ALT、BUN和肌酐在各组间相当。主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的组织学检查显示mRBC@FOLactis治疗小鼠无病理异常。这些发现表明RBC膜包被显著增强了工程化细菌的生物相容性并减轻了炎症反应，从而确保了系统性安全性。

iRGD功能化增强肿瘤穿透

通过细胞穿透肽（CPP）介导的脂质插入策略将mRBC@FOLactis功能化肿瘤穿透肽iRGD。流式细胞术显示肽加载呈剂量依赖性增加，在40 μg时达到饱和。高效液相色谱（HPLC）分析证实了iRGD肽与mRBC@FOLactis的有效结合。共聚焦荧光显微镜提供了肽结合成功的视觉确认，显示DAPI染色的FOLactis细菌（蓝色）、DiI标记的RBC膜（红色）和5-FAM标记的iRGD肽（绿色）的共定位，呈现细菌表面的均匀分布。

iRGD-mRBC@FOLactis增强的肿瘤穿透能力通过A549细胞衍生的三维（3D）肿瘤球体模型评估。iRGD-mRBC@FOLactis治疗组显示整个球体的广泛均匀绿色荧光，证明显著改善的穿透。定量分析确认iRGD-mRBC@FOLactis组的荧光强度显著高于其他组。通过Calcein-AM和碘化丙啶的活/死染色评估细胞毒性效应显示，iRGD-mRBC@FOLactis组呈现最显著的细胞毒性效应。这些结果共同表明RBC膜包被和iRGD功能化的组合显著改善了mRBC@FOLactis的穿透和细胞毒性。

iRGD-mRBC@FOLactis的体内分布

在NSCLC小鼠模型中的体内生物分布研究显示，iRGD-mRBC@FOLactis组在注射后2小时肿瘤部位显示强荧光信号，逐渐增加，在3天达到峰值，然后缓慢减弱。在每个时间点，iRGD修饰组的肿瘤荧光显著高于未修饰组。离体肿瘤成像确认iRGD-mRBC@FOLactis治疗的肿瘤保持比未修饰mRBC@FOLactis治疗更高的荧光强度。淋巴结成像显示iRGD修饰组TDLNs中荧光增强，表明iRGD不仅促进肿瘤靶向，还促进向区域淋巴迁移。

离体菌落形成单位（CFU）分析进一步量化了活细菌的分布。到第3天，iRGD-mRBC@FOLactis组肿瘤包含约三倍多于未修饰组的活细菌。尽管从第7天到第14天肿瘤中CFU逐渐减少，但iRGD-mRBC@FOLactis组维持显著更高的细菌计数。TDLNs中观察到类似趋势，细菌CFU在第3天达到峰值，尽管逐渐下降，但仍显著高于未修饰组。相比之下，两组最初在血液和主要器官（尤其在肝和脾）显示高细菌计数，但这些计数到第7至15天迅速下降，到第15天非靶组织中细菌计数可忽略，组间无显著差异。

iRGD-mRBC@FOLactis与PD-1阻断的协同抗肿瘤效应

在原位肺癌模型中评估iRGD-mRBC@FOLactis与PD-1抗体联合的治疗效果和安全性。通过近红外（NIR）荧光成像动态监测显示，对照组（NS）肿瘤生长最快。PD-1抗体或iRGD-mRBC@FOLactis单药治疗组显示一定肿瘤生长抑制，但肿瘤大小持续增加。相比之下，联合治疗组（iRGD-mRBC@FOLactis + PD-1抗体）显示最弱荧光信号和最小肿瘤大小，表明最显著的肿瘤生长抑制。总荧光强度定量分析显示联合组具有最低荧光强度，表明最有效的肿瘤抑制。统计分析确认联合治疗组比单药治疗组和对照组具有显著更大的肿瘤抑制效应。

关于治疗对小鼠健康的影响，体重在所有组保持稳定，无显著差异，表明治疗未对小鼠整体健康产生不利影响。生存方面，对照组显示最短生存时间。PD-1抗体单独或iRGD-mRBC@FOLactis单独治疗小鼠显示生存时间略有延长，但差异不显著。相比之下，联合治疗组显著优于单药治疗组，具有显著更高的生存率。联合组的中位生存期几乎是对照组的两倍，表明联合治疗不仅有效抑制肿瘤生长，还显著增强生存。

联合治疗对TME的免疫调节效应

对切除肿瘤组织的全面免疫分析显示，联合治疗显著改变了免疫景观。DC亚群分析显示，CD103⁺ DC（cDC1）比例在iRGD-mRBC@FOLactis单药治疗组肿瘤中最低，虽然iRGD-mRBC@FOLactis与PD-1阻断组合产生CD103⁺ DCs的适度增加，但与其他治疗组相比差异无统计学意义。相比之下，CD11b⁺ DC（cDC2）在TME中的百分比未显示iRGD-mRBC@FOLactis单药治疗相对于对照组和PD-1抗体组的优势。然而，在联合组中，CD11b⁺ DC水平恢复至与对照组基本相当的值。值得注意的是，CD8⁺ DCs比例在联合治疗组中显著最高，明确表明添加PD-1阻断能显著促进这一关键亚群在肿瘤中的富集。此外，通过CD80和CD86共表达评估的成熟DCs显示，PD-1抗体单药治疗组显示最低成熟水平，而联合治疗显著增强DC成熟。

TME中T细胞群分析显示，CD8⁺ T细胞活化在对照组（NS）中最低。PD-1抗体或iRGD-mRBC@FOLactis单独治疗产生适度、不显著的CD8⁺ T细胞活性增加。相比之下，iRGD-mRBC@FOLactis与PD-1抗体联合显著增强CD8⁺ T细胞活化，达到显著高于单药治疗组的水平。这种协同表明同时治疗显著促进抗肿瘤免疫反应。

CD4⁺ T细胞亚群的平行分析显示，联合治疗显著增加Th1细胞（以IFN-γ分泌为特征），从而将TME向抗肿瘤表型转变。Th17细胞（由IL-17A产生定义）在联合组中也显著升高，进一步放大免疫反应。值得注意的是，Th2细胞（IL-4⁺ CD4⁺ T细胞）在治疗组间也显示显著差异，表明治疗影响TME中Th2丰度。

此外，Tregs（CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺）在对照组中丰富，与强免疫抑制环境一致。虽然PD-1抗体或iRGD-mRBC@FOLactis单药治疗适度降低Treg水平，但联合治疗诱导显著降低，有效减轻肿瘤相关免疫抑制。

iRGD-mRBC@FOLactis诱导的时间依赖性免疫激活

为进一步描绘免疫调节动力学，检测了iRGD-mRBC@FOLactis治疗后随时间推移的细胞因子释放和免疫细胞浸润。ELISA测定显示，肿瘤和肿瘤引流淋巴结（TDLN）中Flt3L和OX40L浓度迅速增加，在第7天达到峰值，并在第10和15天下降。一致地，多重免疫组化（mIHC）分析揭示了免疫重编程的平行时间模式。CD8⁺ T细胞浸润在第3天已经增强，在第7天达到最大，此后下降。CD11c⁺ DCs遵循相同轨迹，在第7天达到峰值，而CD4⁺ T细胞招募显示更适度的增加，也在第15天减弱。这些发现强调iRGD功能化触发短暂但强劲的免疫激活波，最大细胞因子产生和免疫细胞浸润发生在第7天，随后逐渐下降。

讨论

研究结果确立了静脉注射肿瘤靶向益生菌用于NSCLC治疗的可行性，其中工程化FOLactis用自体RBC膜伪装并用肿瘤穿透iRGD肽功能化。用自体RBC囊泡包裹细菌赋予它们"自我"标记物，如CD47，可抑制巨噬细胞摄取和补体激活，从而延长循环时间并减少全身炎症。这一现象反映了早期研究，其中大肠杆菌Nissle 1917（EcN）用红细胞膜伪装创建"细胞膜包被细菌"（CMCB）。这些隐形细菌显示约14倍更高的血液滞留和42倍更大的肿瘤积累，与未包被EcN相比显著减少全身炎症，同时保持细菌活力和功能。

为进一步改善肿瘤靶向，将环状iRGD肽（CRGDKGPDC）掺入mRBC@FOLactis，利用其与α_vβ₃/α_vβ₅整合素和neuropilin-1的双重结合激活CendR通路。这一过程驱动深层内皮穿透并促进整个肿瘤核心的均匀分布。时间过程荧光和器官CFU共同定义了跨器官的滞留/清除。消除与补体介导的调理作用/裂解、巨噬细胞/DCs的吞噬摄取以及NK细胞细胞毒性一致，碎片由网状内皮系统和肝胆/肾排泄处理。终点化学/血液学、主要器官H&E和血清IL-6/TNF-α支持可接受的安全窗口。

团队先前研究了几种工程化乳酸乳球菌疫苗（FOLactis）的局部递送策略。直接瘤内注射FOLactis引发强局部抗肿瘤免疫反应，以常规1型DCs（cDC1）流入和TME中活化肿瘤浸润T细胞为标志。这些原位疫苗接种方法成功将治疗肿瘤从免疫"冷"状态转化为"热"炎症状态，在某些情况下甚至诱导未治疗远处肿瘤的消退（远隔效应）。然而，这些局部治疗的抗肿瘤活性主要限于递送部位，对播散转移病灶影响有限。因此，治疗区域外肿瘤通常仅获得部分益处，一些初始控制的病灶最终在