L-半胱氨酸触发自组装构建仿生3D S-Cu-S单原子纳米酶作为可逆电子工作站增强类过氧化物酶活性及其在龋齿防治中的应用

本研究通过L-半胱氨酸（L-Cys）触发自组装策略，成功构建了具有三维仿生构型的S-Cu-S单原子纳米酶（MoCC SAzymes），其最大铜单原子负载量达10.11%。该纳米酶展现出卓越的类过氧化物酶（POD）活性，其最大反应速度（4.56×10?7 M s?1）和底物亲和力（米氏常数0.65 mM）分别达到天然辣根过氧化物酶（HRP）的16.3倍和17.9倍。密度泛函理论（DFT）计算揭示其S-Cu-S活性中心可作为可逆电子流工作站，促进电子存储与转移，显著降低羟基自由基（·OH）生成能垒。同时，MoCC在超声（US）刺激下可协同产生级联类过氧化物酶/类催化酶（CAT）活性和声压电催化效应，在酸性口腔微环境中高效生成单线态氧（1O2）和氧气（O2），实现对致龋菌（ Streptococcus mutans ）和生物膜的有效清除，为龋病防治提供了创新性纳米催化策略。

　　

1 引言

纳米酶是一类兼具天然酶和化学催化剂优势的纳米材料，能够克服天然酶易失活、成本高和难储存等缺陷。其中，金属单原子纳米酶（SAzymes）作为新型生物催化剂，因其最大化的原子利用率和明确的电子几何结构而受到广泛关注。铜元素在维持生物体内稳态中发挥关键作用，铜基单原子纳米酶凭借其多酶样行为和良好生物相容性，能够催化细菌细胞内谷胱甘肽（GSH）、蛋白质、核酸和脂质的氧化，诱导细菌凋亡。然而，开发具有天然酶相当活性和选择性的铜单原子纳米酶仍面临挑战。

二硫化钼（MoS₂）纳米片因其高比表面积、易修饰特性和多酶样活性，成为单原子纳米酶的理想载体。受天然酶三维催化口袋结构的启发，本研究通过L-半胱氨酸（L-Cys）配位触发自组装过程，在MoS₂纳米片上构建了具有三维空间定位的S-Cu-S单原子催化中心和相邻L-Cys键合位点，开发出具有增强类酶活性的MoCC单原子纳米酶。

2 结果与讨论

2.1 合成与表征

通过简单的水热法在200°C下反应24小时制备MoS₂纳米片，随后通过L-Cys配位触发自组装策略将铜单原子自动组装到MoS₂表面形成MoCC单原子纳米酶。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）显示MoS₂呈现皱褶的片状结构，平均直径为320纳米。通过调节Cys-Cu-Cys与MoS₂的摩尔比，获得不同铜负载量的MoCC材料，其中MoCC_2:2的铜单原子负载量达到10.11%，被选为后续实验对象。

X射线衍射（XRD）图谱显示MoS₂为2H和1T混合相，而MoCC保持了MoS₂的晶体结构，未发现铜化合物或金属铜的衍射峰。元素映射分析证实了Mo、S和Cu元素在MoCC中的均匀分布。高分辨率TEM显示MoCC具有多层结构，晶面间距为2.57?，表面存在丰富空位。

X射线光电子能谱（XPS）分析表明，MoCC中的Cu以+1和+2价态存在，S-Cu-S键的形成得到确认。球差校正扫描透射电子显微镜（AC-STEM）进一步证实了铜单原子在MoS₂载体上的原子级分散。同步辐射X射线吸收谱（XAS）分析揭示了MoCC中Cu的配位环境和化学价态，确认了S-Cu-S键合构型的形成。

2.2 增强的类酶活性和声压电效应

MoCC表现出卓越的类过氧化物酶（POD）活性，其比活性达到355.59 U mg^?1，在65°C和宽pH范围（2.4-8.2）下仍保持高活性。稳态动力学研究表明，MoCC对H₂O₂底物的最大反应速度（4.56×10^?7 M s^?1）和亲和力（Km=0.65 mM）分别比MoS₂高5.0倍和4.5倍，比天然HRP高16.3倍和17.9倍。

压电力显微镜（PFM）分析证实了MoCC的压电特性，在超声刺激下产生表面正负电荷，增强类过氧化物酶活性。电子自旋共振（ESR）光谱和荧光探针检测证实了MoCC在超声作用下能够高效产生羟基自由基（·OH）和单线态氧（¹O₂）。

此外，MoCC还表现出类催化酶（CAT）活性，在酸性和中性PBS溶液中均能促进O₂生成，最高产氧量出现在MoCC_2:2组，表明最佳铜负载量触发了增强的类催化酶活性。

2.3 DFT计算

密度泛函理论计算揭示了MoCC的催化机制。差分电荷密度分析和Bader电荷分析表明，电子通过自组装的Cu单原子三维S-Cu-S催化口袋流向MoS₂并存储其中。在类过氧化物酶催化过程中，存储在MoS₂中的电子可逆地流向三维催化口袋，实现与H₂O₂的快速电子交换，降低反应能垒。

计算发现MoCC建立了双路径电子转移机制，其中路径II能够自发释放·OH，维持负的自由能变化（-0.67 eV）。三维S-Cu-S结构模拟了天然HRP的催化口袋，有利于底物结合，且原本存储在MoS₂中的电子通过L-Cys稳定的电子桥可逆转移，使MoCC能够根据H₂O₂分解需求调整电子分布，降低总体反应能垒。

2.4 抗菌性能

以龋病主要致病菌 Streptococcus mutans 为模型，评估了MoCC的杀菌效能。细胞内活性氧水平检测显示，MoCC + H₂O₂组的荧光强度分别是Cys-Cu-Cys + H₂O₂和MoS₂ + H₂O₂组的8.48倍和2.54倍。平板计数法显示MoCC + H₂O₂ + US组的细菌存活率最低（1.41%），表明超声放大的类过氧化物酶级联活性氧风暴具有卓越的抗菌性能。

扫描电镜观察显示，MoCC处理导致细菌细胞壁严重破坏，细胞明显扁平或碎片化。活/死染色证实MoCC + H₂O₂组死亡细菌比例达74.39%，而MoCC + H₂O₂ + US组进一步提高到87.3%。

2.5 口腔生物膜清除和牙齿美白

晶体紫染色显示MoCC + H₂O₂组实现了56.97%的生物膜灭活，超声处理后提高到65.53%。生物膜干重减少80.13%，多糖含量降至12.16%。EPS网络荧光标记显示MoCC处理后EPS网络几乎检测不到，表明级联活性氧风暴有效清除了生物膜。

牙齿美白实验表明，MoCC + H₂O₂组对罗丹明B的降解率达到62.5%，超声处理后仅剩余13.9%。CIE-lab系统定量评估显示，MoCC处理组的a和b值（代表染色强度）显著降低，L值（代表亮度）明显增加，表明牙齿美白效果显著。

2.6 体内龋齿预防

通过SD大鼠建立龋齿模型，评估MoCC的体内防龋效果。将MoCC封装在海藻酸钠中并与Ca²⁺交联，形成牙齿冠部的 hydrogel 涂层。20天治疗后，所有组别体重均正常增长，表明对SD大鼠整体健康无不良影响。

口腔细菌负载量分析显示，MoCC + H₂O₂ + US组的细菌负载量降至13.6%，表现出卓越的防龋效果。微计算机断层扫描（Micro-CT）显示MoCC处理组釉质密度减少较少，放射性透亮病变最小。茜素红染色显示MoCC处理组龋坏仅限于釉质和浅层牙本质。

血液学参数分析未发现异常，溶血率低于4%，组织学分析显示腭部、舌部和主要器官无组织损伤、炎症或MoCC积聚，证实了MoCC的良好生物相容性。

2.7 口腔微生物群落变化

16S rRNA测序分析显示，MoCC处理组的微生物丰富度和均匀度保持稳定。主坐标分析（PCoA）表明MoCC + H₂O₂和MoCC + H₂O₂ + US组的微生物组成与对照组有显著差异。属水平热图证实MoCC处理组 Streptococcus 丰度显著降低，而 Corynebacterium 仍占主导地位，表明MoCC能有效抑制病原菌定植，对原生微生物影响最小。

LEfSe和线性判别分析（LDA）确定 Streptococcus 是区分有效组的关键标志物，证实了MoCC + H₂O₂和MoCC + H₂O₂ + US组的强抗菌效果。这些发现表明MoCC具有有效的病原清除能力，同时保护有益细菌，是龋齿预防的有前途候选材料。

3 结论

本研究报道了通过L-Cys触发自组装过程构建的仿生铜单原子MoCC单原子纳米酶，其具有三维S-Cu-S催化位点，实现了10.11%的高铜单原子负载量。优化的MoCC表现出卓越的类过氧化物酶活性，其最大反应速度和底物亲和力分别达到天然HRP的16.3倍和17.9倍。DFT计算揭示S-Cu-S催化口袋作为电子流工作站，实现电子存储和转移，显著降低反应能垒。

与先前报道的MoS₂负载单原子纳米酶相比，MoCC具有一步法L-Cys引导组装、高铜单原子负载和优越催化动力学性能的特点。与常规铜基纳米酶相比，MoCC独特地结合了温和的室温制备条件和原子级分散的明确活性中心，兼具结构精确性和实际可扩展性。

此外，MoCC在超声刺激下展现出级联类过氧化物酶/类催化酶活性和声压电催化效应，在酸性口腔微环境中协同产生·OH、O₂和¹O₂。这种多自由基系统对 Streptococcus mutans 具有强效杀菌效果，体外实现98.59%的细菌杀灭，体内显著降低龋坏严重程度。酸性口腔微环境响应性活性氧风暴有效降解生物膜，通过降解有机色素恢复牙齿洁白度。

重要的是，MoCC在生理条件下保持良好的生物相容性和稳定性，对共生口腔微生物群影响极小，支持其转化为口腔保健形式（如涂层、漱口水或超声触发牙贴）的潜力。这项工作建立了一种仿生、非侵入性的催化策略，用于将纳米酶激活为三维L-Cys稳定的铜单原子纳米酶，促进类过氧化物酶活性超越天然HRP。L-Cys触发自组装和可逆电子转移机制为设计高性能纳米酶提供了宝贵见解。