近红外调控三金属纳米酶智能水凝胶实现细菌杀伤与氧化应激缓解的协同治疗新策略

本研究开发了一种基于多粘菌素B修饰的三金属纳米酶（AuMnCu）与智能水凝胶（AMCB-FTB）的协同治疗体系，通过近红外-I（NIR-I）温和光热效应增强纳米酶催化活性，实现感染微环境响应性杀菌（ROS生成）与后期抗氧化（ROS清除/氧气生成）的动态切换，为糖尿病难愈性创面及感染性疾病治疗提供了新型自适应材料平台。

　　

1 引言

感染性创面治疗面临细菌耐药性、过度炎症反应和组织再生受阻等多重挑战。活性氧（ROS）在伤口愈合过程中发挥双重作用：早期作为抗菌剂，但过量积累会导致氧化应激和组织损伤。传统抗生素和单功能纳米酶难以实现ROS稳态的动态调控。纳米酶因其类酶活性和稳定性成为ROS调控的新兴策略，但现有系统缺乏对感染微环境动态变化的响应能力。本研究通过构建光热增强型三金属纳米酶水凝胶系统，实现了杀菌-抗炎-促再生的程序化治疗。

2.1 Au NPs、AMC和AMCB的合成与表征

通过单宁酸（TA）和抗坏血酸（AA）一步还原法合成金纳米粒子（Au NPs），透射电镜（TEM）证实其成功制备。引入锰（Mn²⁺）和铜（Cu²⁺）离子与Au NPs表面的TA反应形成三金属纳米酶（AMC），进一步通过酰胺反应连接多粘菌素B（PMB）获得AMCB。动态光散射（DLS）显示AMCB水合粒径为185.8 nm，zeta电位为+1.52 mV。X射线光电子能谱（XPS）证实Cu²⁺和Mn²⁺为主价态，赋予其谷胱甘肽（GSH）耗竭能力。紫外-可见光谱显示AMCB在500-900 nm有宽吸收带，适用于808 nm激光激发的光热治疗。

2.2 酸性条件下AMCB的酶模拟活性

在酸性条件下，AMCB表现出显著的过氧化物酶（POD）样和NADH氧化酶样活性。稳态动力学分析显示其对H₂O₂的催化效率（TON=9.59×10^?3 s^?1）优于辣根过氧化物酶（HRP）。自由基淬灭实验证实其主要产生·OH和¹O₂。NADH氧化实验表明AMCB可破坏细菌能量代谢。此外，AMCB展现出谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）样活性，10分钟内可消耗100 μM GSH。罗丹明B（RhB）降解实验证明其在H₂O₂和GSH共存时ROS生成能力最强。

2.3 AMCB-FTB水凝胶的制备与表征

通过3-甲酰基苯硼酸（FPBA）、妥布霉素（TOB）和TA构建动态共价水凝胶。流变学测试表明FTB和AMCB-FTB的凝胶形成时间为60秒，且具有剪切稀化和温度响应特性（42.2°C发生凝胶-溶胶转变）。AMCB-FTB的光热转换效率达46.5%，且经历10次激光开关循环后仍保持稳定。等温滴定量热（ITC）显示近红外照射可增强纳米酶与底物的结合亲和力（POD样活性K_a从3.60×10⁵增至4.78×10⁵ M^?1）。

2.4 AMCB-FTB的抗菌活性

对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和大肠杆菌（E. coli）的抗菌实验表明，AMCB-FTB+H₂O₂+NIR组的抑菌率达99.95%以上。活/死细菌染色和扫描电镜（SEM）显示该处理组引起细菌膜严重破损和内容物泄漏。膜电位探针DiOC₂(3)检测证实膜去极化现象。DCFH-DA荧光探针显示细胞内ROS水平显著升高。水凝胶的酸响应和温度响应特性促进了TOB和TA的控释，两者在500 μg/mL和25 μg/L浓度下分别表现出40%左右的抑菌率。

2.5 体外抗生物膜活性

AMCB-FTB+H₂O₂+NIR处理可几乎完全清除成熟生物膜，并抑制新生物膜形成。激光共聚焦显微镜显示生物膜三维结构被破坏。RT-PCR分析表明群体感应相关基因（如lasI、rhlI）和毒力基因显著下调。胞外DNA（eDNA）、胞外多糖（EPS）和蛋白酶活性测定证实生物膜基质成分减少。铜绿假单胞菌的绿脓菌素产量也明显下降。

2.6 RNA测序分析

转录组学分析发现AMCB-FTB+NIR+H₂O₂处理组共有1765个差异表达基因（1029个上调，736个下调）。KEGG富集分析显示氨基酸代谢、脂肪酸代谢、鞭毛组装和群体感应通路显著改变。蛋白互作网络表明能量代谢、细菌细胞结构完整性和生物膜形成相关基因受到严重影响。RT-PCR验证显示ftsI、phoP、motD等关键基因表达显著变化。

2.7 中性条件下AMCB的酶模拟活性

在中性pH条件下，AMCB表现出超氧化物歧化酶（SOD）样、过氧化氢酶（CAT）样和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）样活性。NBT法检测到37.81%的·O₂^?清除率，CAT样活性使H₂O₂清除率达65.49%。DPPH自由基清除实验显示180分钟内清除率42.63%。细胞实验中，AMCB有效降低H₂O₂诱导的细胞内ROS水平，并提高氧浓度。

2.8 巨噬细胞表型调控与细胞迁移增强

AMCB-FTB具有良好的生物相容性（细胞存活率>90%）。划痕实验和Transwell实验表明其显著促进细胞迁移。LPS诱导的炎症模型中，AMCB-FTB下调M1型标志物（IL-6、TNF-α、iNOS），上调M2型标志物（IL-10、CD206、TGF-β1）。流式细胞术检测到CD206阳性细胞比例从0.019%增至12.9%。qRT-PCR显示血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和III型胶原（COL-III）基因表达上调。

2.9 体内治疗效能评估

铜绿假单胞菌感染小鼠模型中，AMCB-FTB+NIR组在第7天伤口愈合率达99.38%，细菌抑制率99.95%。组织学分析显示该组表皮完整、胶原纤维丰富且无炎症细胞浸润。免疫荧光检测到IL-6表达下降而VEGF表达上升。血液学参数（WBC、LY、Neut）和肝肾功能指标（ALT、AST、BUN、CR）均恢复正常水平。

2.10 生物相容性评价

主要器官H&E染色未发现病理变化。溶血率低于5%，血液凝固指数（BCI）为7.04%。小鼠体重无显著变化，证实系统具有良好的生物安全性。

3 结论

该研究开发的AMCB-FTB智能水凝胶通过光热控释、纳米酶催化、ROS动态调控和多机制抗菌的协同作用，实现了感染微环境自适应治疗，为难愈性创面提供了新型治疗策略。