钙羧酸盐金属有机框架（CaIDC）一锅法封装酶：提升缓冲稳定性与机器学习辅助优化的新策略

本综述系统介绍了在室温水相中构建钙羧酸盐金属有机框架（CaIDC）用于酶封装的新方法。通过机器学习（ML）辅助优化（如拉丁超立方采样LHS和贝叶斯优化BO），显著提高了封装效率（EE）、保留酶活性（REA）及蛋白质负载量（Ploading）。与沸石咪唑酯框架（ZIF）相比，CaIDC基生物复合材料在磷酸盐缓冲液（PB，pH 6.0和7.4）中展现出更优异的化学稳定性，为酶固定化技术和生物催化应用提供了更稳健的平台。

　　

1 引言

酶催化反应因其在温和条件下（常温、常压、中性pH）的高反应性、高效性和立体选择性，在化学生产和工业应用中具有重要价值。然而，酶对环境压力因素（如极端pH、有机溶剂、高温及长时间使用）的敏感性以及回收利用困难，限制了其实际应用。酶固定化技术是解决这些挑战的有效策略，能够增强酶在工业操作条件下的适应性和经济可持续性。近年来，金属有机框架（MOF）作为酶固定化的平台受到广泛关注。其中，沸石咪唑酯框架（ZIF）因其可在室温水相中合成而被广泛研究，但ZIF材料在常见生物缓冲液（如磷酸盐缓冲液PB）中易逐渐分解。为提高稳定性，研究转向探索配位键更强的羧酸盐MOF平台，如UiO-66、MIL-101等，但这些材料的合成通常需要有机溶剂或极端pH条件。

本研究聚焦于由Ca²⁺和4,5-咪唑二羧酸（IDC）配体构建的MOF（CaIDC），用于酶固定化。Ca²⁺与羧酸配体的强配位作用以及IDC的中等水溶性和多样配位模式，使CaIDC在缓冲溶液中表现出优于ZIF的化学稳定性。研究采用一锅法合成策略，将酶与Ca²⁺、IDC在水相中混合，通过共沉淀或仿生矿化机制实现酶的原位封装。

2 结果与讨论

研究首先以荧光标记的牛血清白蛋白（FBSA）为模型蛋白，探索CaIDC的合成可行性。通过调整Ca²⁺、IDC和酶的浓度，利用机器学习辅助的工作流程（结合拉丁超立方采样LHS和随机森林RF模型）对合成条件进行高效优化。经过105次实验，成功筛选出最优的FBSA@CaIDC样品（FBC78），其封装效率（EE）达85.4%，蛋白质负载量（P_loading）为16.1 wt%。粉末X射线衍射（PXRD）表征显示，大多数样品选择性地结晶为[Ca(IDC)(H₂O)₄]·H₂O（CaIDC），且具有[010]晶面的优先生长。

与ZIF基生物复合材料相比，CaIDC基材料在PB缓冲液（pH 6.0和7.4）中表现出显著增强的化学稳定性。例如，FBSA@ZIF在pH 7.4的PB中会出现酶泄漏（最高23.8%），而在pH 6.0时甚至完全分解；而FBC78在相同条件下仅释放12.5%的酶，并能保持晶体结构完整性。此外，研究还通过层层生长策略成功制备了核壳结构的CaIDC生物复合材料（FBC78_2nd），展示了多酶封装的应用潜力。

研究进一步拓展了CaIDC平台的普适性，成功封装了葡萄糖氧化酶（GOx）、过氧化氢酶（CAT）和酯酶（EST），分别得到FGOx@CaIDC、FCAT@CaIDC和FEST@CaIDC。这些复合材料均保持与CaIDC相同的晶体结构和形貌，但酶的空间分布和负载参数因酶表面电荷性质的不同而有所差异。zeta电位测量显示，FGOx表面电荷最负（-18.18 mV），这可能影响其与CaIDC特定晶面的相互作用。

以酯酶（EST）为模型系统，研究通过ML优化得到了最优的EST@CaIDC样品（EC19），其EE、REA和P_loading分别为28.7%、20.1%和4.2 wt%。EC19在循环使用中表现出良好的稳定性，三次循环后活性损失可忽略不计；而EST@ZIF在相同条件下活性损失达52.6%。荧光光谱和二阶导数分析表明，封装后EST的三级结构未发生明显扰动，证实了CaIDC封装的生物相容性。

3 结论

本研究开发了一种在水相室温下合成CaIDC基生物复合材料的新方法。与ZIF基材料相比，CaIDC在PB缓冲液中具有更优异的化学稳定性，适用于多种酶的固定化。通过机器学习辅助的工作流程（结合LHS和BO算法），高效优化了合成条件，显著减少了实验次数。优化的EST@CaIDC（EC19）在封装效率、酶活性和蛋白质负载量方面均表现出良好性能。该研究不仅展示了CaIDC作为酶固定化平台的潜力，还为生物分子保护和酶固定化技术的发展提供了高效的优化策略。

4 实验部分

实验部分详细描述了材料合成、表征和分析方法。包括荧光标记酶的制备、系统筛选FBSA/CaIDC和EST/CaIDC的流程、最优样品（FBC78和EC19）的合成步骤、ZIF对照样品的制备以及各种表征技术（如PXRD、ATR-FTIR、CLSM、SEM、SAXRD、77K N₂吸附、zeta电位测量、NMR等）。酶封装效率（EE）通过BCA assay测定，酶活性（REA）通过水解对硝基苯乙酸酯（NPA）的反应速率评估。机器学习算法采用随机森林（RF）模型，结合贝叶斯优化（BO）进行实验规划。