靶向自噬的铁铜纳米酶重塑肿瘤免疫微环境并实现影像引导的癌症免疫治疗

本研究发现一种新型铁铜金属有机框架（Fe–Cu MOFs）纳米酶，通过模拟多种酶活性（POD/GPx/OXD-like）诱导氧化应激并阻断自噬流，有效恢复肿瘤细胞MHC-I表达，重塑免疫抑制微环境（TIME）。联合低剂量氯喹（CQ）和全氟己烷（PFH）构建的多功能纳米平台（FCMP@CQ/PFH）进一步协同抑制自噬，促进M2型巨噬细胞向M1型极化，增强CD8+ T细胞浸润，为超声引导的肿瘤免疫联合治疗提供新策略。

　　

2.1 Fe-Cu MOFs (11:4) Optimally Inhibit Autophagy and Enhance MHC-I Expression

研究团队通过合成不同铁铜摩尔比例（11:4、1:1、4:11）的Fe-Cu MOFs以及单金属MOFs，系统评估了它们对自噬流的抑制作用。透射电镜图像显示所有MOFs均呈现规整的形貌。细胞毒性实验表明，Fe:Cu为11:4的MOFs对MC38和4T1细胞具有最强的杀伤效果。Western blot分析显示，所有MOFs处理均导致LC3-II和p62的剂量依赖性积累，表明自噬流被有效阻断。特别值得注意的是，Fe-Cu MOFs (11:4)诱导了最高程度的p62积累，表明其具有最强的自噬流抑制能力。

机制研究表明，Fe-Cu MOFs (11:4)处理导致溶酶体碱化（Lyso-Sensor Green荧光强度降低），并阻碍自噬体与溶酶体的融合（LC3与LAMP1共定位减少）。这些纳米酶还显著上调了MHC-I的表面和总蛋白表达，在MC38和4T1细胞中均观察到最明显的MHC-I表达增强。这些发现表明Fe-Cu MOFs (11:4)不仅能有效抑制自噬流，还能增强免疫识别能力。

2.2 Characterization and Enzymatic Activity Evaluation of FCMP

研究人员进一步对优化的Fe-Cu MOFs (11:4)进行表面修饰，包裹聚多巴胺（PDA）并功能化mPEG-NH₂，得到最终粒径约130 nm的FCMP纳米颗粒。XPS分析证实Cu以Cu²⁺和Cu⁺形式存在，Fe以Fe²⁺和Fe³⁺形式存在，XRD图谱显示材料为纯相的CuFe₂S₃结构。

酶活性评估显示，Fe-Cu MOFs (11:4)表现出最强的类过氧化物酶（POD-like）活性，能有效催化TMB氧化。ESR光谱证实该纳米酶能在H₂O₂存在下产生·OH自由基，且·OH信号强度随时间延长而增强。同时，纳米酶还表现出谷胱甘肽过氧化物酶（GPx-like）样活性，能时间依赖性和浓度依赖性地消耗GSH。此外，该材料还具有类氧化物酶（OXD-like）活性，能产生·O₂^-自由基。这些多重酶模拟活性使FCMP能有效诱导氧化应激和 redox失衡。

2.3 FCMP Triggers Autophagy Initiation via AMPK-mTOR Pathway and Blocks Late-stage Autophagic Flux

研究发现FCMP纳米酶能浓度依赖性地增加细胞内ROS水平。当用ROS清除剂NAC共同处理时，FCMP诱导的p62积累和LC3-II积累显著减少，表明ROS在自噬流阻断中起关键作用。

Western blot分析显示，FCMP处理激活了AMPK（Thr172磷酸化）及其下游靶点ULK1（Ser555磷酸化），同时抑制了mTOR及其下游底物p70S6K的磷酸化，表明FCMP通过ROS介导的AMPK-ULK1轴激活和mTOR信号抑制来诱导自噬起始。

使用自噬抑制剂wortmannin（抑制自噬体形成）和bafilomycin A1（抑制自噬体-溶酶体融合）的实验表明，FCMP类似于Baf-A1，主要作用于自噬晚期阶段，阻碍自噬体与溶酶体的融合。GFP-LC3实验显示FCMP处理增加了GFP-LC3斑点但未能产生游离GFP，进一步证实自噬流在晚期被阻断。Magic Red染色显示cathepsin B活性降低，表明溶酶体功能受损。

2.4 Synthesis and Characterization of FCMP@CQ/PFH and Its Imaging Performance

为进一步增强自噬抑制效果，研究人员开发了多功能纳米平台FCMP@CQ/PFH，通过疏水相互作用和负压法将CQ和PFH装载到FCM中，然后进行PDA包覆和mPEG-NH₂修饰。TEM显示纳米颗粒呈球形，PDA层清晰可见。EDS元素映射证实了Fe、Cu、S、F、C、N、O元素的存在。

该纳米系统表现出良好的稳定性，在不同缓冲介质中能保持结构完整性一周。在模拟肿瘤还原环境的条件下（10 mM GSH），纳米颗粒出现时间依赖性降解，显示其GSH响应性。药物释放研究表明，在酸性环境（pH 6.5）和GSH存在下，CQ释放显著增强，超声暴露进一步促进了药物释放，这归因于全氟碳微泡的空化效应。超声成像实验证实FCMP@CQ/PFH在体内外均能显著增强超声信号。

2.5 Therapeutic Efficacy and Immunotherapy Capabilities of FCMP@CQ/PFH In Vitro

体外实验表明，FCMP@CQ/PFH + US处理能最有效地抑制自噬，LC3-II和p62积累程度超过游离CQ或FCMP单独处理。细胞毒性实验显示，FCMP@CQ在CQ浓度为4 μg mL^-1时表现出最强的协同抗肿瘤效果，而单独US处理对细胞活力影响很小。

FCMP@CQ/PFH对正常细胞（HUVEC和MCF10A）表现出良好的生物相容性，细胞活力保持在80%以上。流式细胞术分析显示，FCMP@CQ/PFH + US处理诱导最高比例的细胞凋亡（MC38细胞中达47.2%）。克隆形成实验表明，该处理能有效消除肿瘤细胞克隆，伤口愈合实验显示其显著抑制肿瘤细胞迁移。

免疫调节功能研究表明，FCMP处理使MHC-I⁺细胞比例显著增加（MC38细胞中从17.4%增至41.4%）。此外，FCMP@CQ/PFH + US处理能有效促进巨噬细胞从M2型向M1型极化，上调CD86表达，下调CD206表达。

2.6 Antitumor Efficacy of FCMP@CQ/PFH in a Murine Colorectal Cancer Model

体内分布实验显示，Cy5.5标记的FCMP@CQ/PFH在注射后8小时开始在肿瘤部位积累，24小时达到峰值，表明其具有良好的肿瘤靶向能力。

在MC38肿瘤模型中，FCMP@CQ/PFH + US处理表现出最强的肿瘤生长抑制效果，几乎完全消除肿瘤且复发很少。肿瘤重量分析和H&E染色证实该处理组肿瘤组织损伤最严重。TUNEL染色显示凋亡增加，Ki67染色显示增殖细胞减少。所有处理组小鼠体重无显著变化，主要器官H&E染色和血清生化指标均未发现异常，表明良好的生物安全性。

2.7 Autophagic Flux Blockade, Polarization of TAMs and Immune Response Activation Induced by FCMP@CQ/PFH in the MC38 Tumor-Bearing Mouse Model

免疫组化分析显示，FCMP@CQ/PFH + US处理组LC3和p62表达显著上调，表明自噬流被有效阻断。流式细胞术分析表明，该处理能有效促进TAM从M2型向M1型极化，减少M2型巨噬细胞比例，增加M1型巨噬细胞比例。

T细胞分析显示，FCMP@CQ/PFH + US处理组肿瘤中CD3⁺ T细胞浸润最多，CD4⁺和CD8⁺ T细胞群体均显著富集。同时，该处理还能显著降低Treg细胞比例，减轻免疫抑制。ELISA检测显示，FCMP@CQ/PFH + US处理组血清中IFN-γ水平最高。

2.8 Antitumor Efficacy and Immune Response of FCMP@CQ/PFH in an Orthotopic Breast Cancer Model

在4T1原位乳腺癌模型中，FCMP@CQ/PFH + US处理表现出最强的原发性肿瘤生长抑制效果，肿瘤体积和重量最小。肺转移分析显示，该处理能显著减少肺转移结节数量，而对照组、单独US组和游离CQ组均表现出明显的转移负担。

免疫分析进一步证实，FCMP@CQ/PFH + US处理能有效促进M2向M1型巨噬细胞极化，增加CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润，降低Treg比例，并提高IFN-γ分泌水平。所有这些免疫调节效应共同贡献了增强的抗肿瘤免疫力。

3 Conclusion

该研究成功构建了一种整合氧化还原酶功能的纳米平台FCMP@CQ/PFH，能有效整合超声介导的治疗与自噬流阻断和免疫激活。通过利用Fe-Cu MOFs的多种酶模拟活性，该系统诱导氧化应激和redox失衡，有效破坏肿瘤细胞内的自噬。CQ的共递送通过阻止自噬体-溶酶体融合进一步放大自噬抑制，共同恢复MHC-I表达和逆转免疫逃逸。PFH在响应超声时发生相变，允许实时监测治疗效果。该纳米平台通过抑制自噬流、促进M2向M1型巨噬细胞极化、增强细胞毒性T淋巴细胞浸润和减少Treg介导的免疫抑制，发挥显著的协同抗肿瘤作用，最终抑制肿瘤进展和转移。

4 Experimental Section

详细实验方法列于支持信息中。动物护理和维护遵循华南理工大学实验室动物指南，并获得华南理工大学动物护理和使用委员会的批准。