钙质海绵（Calcarea, Porifera）两种物种的胚后发育与异腔骨针水系（Heterocoelic Aquiferous System）形成的比较研究：揭示多孔动物门主要共衍征的个体发育机制与演化路径

《Molecular Reproduction and Development》：Post-Embryonic Development and Formation of the Heterocoelic Aquiferous System in Two Species of Calcareous Sponges (Calcarea, Porifera)

本综述系统阐述了钙质海绵（Calcarea）中Sycettusa hastifera（syconoid型）与Paraleucilla magna（leuconoid型）的幼虫变态（metamorphosis）、奥林托斯（olynthus）形成及异腔水系（AS）发育过程。研究揭示了其通过上皮形态发生（epithelial morphogenesis）形成异腔水系，与寻常海绵纲（Demospongiae）的间充质-上皮转化路径不同，而与同骨海绵纲（Homoscleromorpha）更为相似。该研究为理解多孔动物门主要共衍征——水系（AS）的个体发育（ontogeny）与演化提供了关键形态学基础。

　　

2 Materials and Methods

2.1 Investigated Species

本研究聚焦钙质海绵纲（Calcarea）的两个代表物种：Sycettusa hastifera（syconoid型水系）与Paraleucilla magna（leuconoid型水系）。前者具辐射状领细胞室（choanocyte chamber）及皮层（cortex），采集自巴西里约热内卢Arraial do Cabo的Forno海滩，被视为入侵物种；后者领细胞室球形且分散于厚实的中胶层（choanosome）中，同样在巴西被视为入侵种。两物种均呈现半连续繁殖特性，S. hastifera繁殖高峰间隔出现，而P. magna则全年持续释放幼虫。

2.2 Collection of Adults and Maintenance of Juveniles

成虫于2007年3月至2011年7月期间采集。幼虫通过静置培养皿于室温（约25°C）下诱导释放，并通过离心（<1000 rpm, 5 min）方式进行富集。幼虫置于60 mm塑料培养皿中，底部放置盖玻片（24×24×0.17 mm）以利固定与染色。幼体维持过程中每2天换水，并每日通过连接 Pasteur 移液管的 aquarium pump 进行曝气。1周后，培养皿被转移至60 L循环海水水族箱中以增加营养供给。

2.3 Characterization of Post-Embryonic Development

通过体视显微镜、倒置显微镜（配备相差PC与微分干涉DIC镜头）、以及激光共聚焦显微镜（LSCM）对幼虫行为、变态及水系发育进行活体观察。利用ImageJ软件进行时序动画分析。样品采用Bouin液固定6 h（室温），经酸性胭脂红（CA）或苏木精-伊红（HE）染色后全装片观察。透射电镜样品则经戊二醛-锇酸双重固定、丙酮脱水、Epon树脂包埋后切片观察。

3 Results

P. magna通常在采集后3 h内释放超过1000个幼虫，无特定昼夜或月相偏好；S. hastifera释放则多发生于早晨。两物种的两囊幼虫（amphiblastula）形态相似：前极为纤毛细胞，赤道区为交叉细胞，后极为颗粒细胞。S. hastifera幼虫略大（约50 μm），纤毛更长。幼虫释放后浮至水面旋转游动（顺时针方向），游泳时间通常为P. magna约3 h、S. hastifera约12 h。离心处理偶尔导致幼虫形态改变，但不影响其行为与发育。

幼虫沉底后以纤毛极测试基质，旋转探查，随后开始变态。

3.1 Post-Embryonic Development of S. hastifera

幼虫经历较长时间基质测试后，前极内陷入幼虫腔完成变态（<10 min）。颗粒细胞铺展分化成扁细胞（pinacocyte）附着基质，内陷细胞形成内细胞团（ICM）。约30 min后幼体开始收缩外围延伸，1 h后首个小针（diactine）骨针从ICM分泌并突出体表。2 h后幼体呈球形，体表密布小针骨针（hispid）。第1天末，ICM空化形成单领细胞腔室，开启于原始出水孔（osculum），形成asconoid型水系（奥林托斯）。第2天出现三射骨针（triactine），第5天领细胞层（choanoderm）向外折叠形成首轮辐射状领细胞室（syconoid型）。

3.2 Post-Embryonic Development of P. magna

变态迅速（约10 min），纤毛极内陷形成临时孔道，随后由颗粒细胞分化的基扁细胞（basopinacocyte）封闭。颗粒细胞形成外扁细胞（exopinacocyte），纤毛细胞形成ICM。幼体铺展时细胞含大量储备颗粒，ICM细胞运动剧烈。约5 h后出现皮下空间（未来中胶层mesohyl），其中快速运动的小细胞（约2 μm）可能为lophocyte，分泌胶原纤维（collagen fibril）。约6 h领细胞（choanocyte）在ICM中分化，7 h后由扁细胞运动形成原始出水孔（直径约10 μm）。骨针发生与原始水系形成同步：首个小针骨针（具median-swelling）由ICM中的骨细胞（sclerocyte）分泌，随后被运至外围；1-2天后三射骨针开始形成，由三个骨细胞分泌三角形晶核后生长而成。

幼体保持柱形至约16天，基部拓宽，领细胞层向中央腔（spongocoel）内陷，隔离领细胞群形成球形领细胞室（leuconoid型）。连续内陷形成多个室，最终发育为吸入管（inhalant canal）与辐射状水系。8周后个体呈现典型leuconoid水系，具宽阔心房（atrium）与球形领细胞室。

4 Discussion

两物种变态均涉及纤毛极内陷与颗粒细胞铺展，纤毛细胞形成ICM（分化领细胞、骨细胞、变形细胞），颗粒细胞形成扁细胞。早期水系均为asconoid型，首骨针为小针。异腔水系形成似乎均经由上皮形态发生：S. hastifera领细胞层向外翻折（evagination）形成syconoid，P. magna则向内陷（invagination）形成leuconoid。该过程与寻常海绵纲（Demospongiae）的间充质-上皮转化（mesenchymal-to-epithelial morphogenesis）不同，而与同骨海绵纲（Homoscleromorpha）的上皮形态发生相似。

离心处理对多数幼虫无影响，但某些物种（如Grantia compressa）则受影响，表明物种特异性反应。幼虫释放可能由应激触发，P. magna因幼虫孵化于epilarval trophocytes epithelium可能更易释放未成熟幼虫。

骨针发生受钙离子浓度与蛋白质合成调控。P. magna幼体在低水量环境下延迟骨针分泌，换水后改直接分泌三射骨针，表明环境钙浓度可调控骨针类型与发育时序，可能引发表型变异甚至新种形成。

钙质海绵发育过程中的上皮折叠（invagination/evagination）由细胞骨架重排（顶端F-actin与肌球蛋白II积累）驱动，尽管其缺乏典型上皮连接（如zonula adherens）与基膜，但功能上表现真正上皮特性。分子机制如laminin与focal adhesion kinase（FAK）可能参与调控，有待进一步研究。

水系类型演化可能涉及多次独立起源。系统发育显示leuconoid型在钙质海绵中至少独立出现四次，部分祖先可能具syconoid型。但发育过程无重演现象（P. magna不经过syconoid阶段），且水系命名混乱可能导致同塑性误判。结合精细形态描述与发育研究将有助于厘清演化路径。

钙质海绵因其对称性、极性及多重发育事件，再度成为后生动物演化研究的重要模型。S. ciliatum基因组中含许多与真后生动物发育相关基因，支持其基础地位。本研究表征的胚后发育过程为未来研究胃胚形成（gastrulation）、上皮形成、水系发育及生物矿化提供了框架，这些事件不仅对多孔动物门，亦对整个后生动物演化至关重要。