铁离子通过增强活性氧生成并启动内皮细胞中性粒细胞胞外诱捕网形成以加剧脑卒中

本综述深入探讨了脑缺血再灌注（CI/R）损伤中内皮源性活性氧（ROS）与游离铁水平调控中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成的核心机制。研究揭示了缺氧/复氧（H/R）条件下，内皮细胞（ECs）而非中性粒细胞是NETs形成的主要启动者，并通过干预铁代谢（沉默Fpn1）和抗氧化（维生素C, Vc）及铁螯合（去铁胺, DFOM）治疗，证实了靶向ROS与铁可显著抑制NETs并减轻卒中损伤。结合动物模型（MCAO/R）证明Vc与DFOM联用具有协同神经保护作用，为临床卒中治疗提供了新颖且极具转化潜力的策略。

　　

1 引言

脑卒中因大脑血液供应中断或血管完整性丧失所致，已成为全球第二大死因和第三大致残原因，其疾病负担在过去三十年中几乎翻倍。缺血性卒中约占所有卒中病例的87%，尽管现有治疗方法如重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）能在症状出现后3小时内改善功能预后，但并未显著提高生存率，这凸显了开发卒中急性期新治疗策略的迫切性。

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）已成为卒中后神经元损伤的关键贡献者。浸润的中性粒细胞在受损大脑中被激活并释放NETs，随后破坏血脑屏障（BBB）、抑制新生血管形成、诱导神经功能缺损并加剧卒中预后。NETs在脑血栓中的丰度高于冠状动脉血栓，并随血栓形成时间增加，导致溶栓抵抗。因此，NETs的存在与缺血性卒中患者的疾病严重程度和不良预后呈正相关。相反，靶向中性粒细胞以减少NETs形成已被证明可减轻炎症、改善神经功能并提高卒中模型中的存活率。

及时恢复血流仍是卒中管理的首要治疗目标。然而，卒中后的再灌注常导致脑缺血/再灌注（CI/R）损伤，从而加剧神经元损伤。CI/R损伤的关键机制之一是活性氧（ROS）的生成。缺血和缺氧导致脑细胞能量衰竭，引起糖酵解中断、离子失衡和线粒体损伤。这些事件共同导致再灌注期间过量的ROS产生，引起氧化应激、铁死亡、NETs形成和血管损伤。在临床前研究中，ROS清除已证明具有神经保护作用并能减轻CI/R损伤，这表明靶向ROS是最大限度减少再灌注后神经元损伤的可行策略。

中枢神经系统主要包含常驻免疫细胞，如脑实质中的小胶质细胞，以及脑-血管界面处较少的中枢神经系统相关巨噬细胞。因此，卒中后大多数形成NETs的中性粒细胞来源于通过循环进入的骨髓。尽管有研究表明脑内浸润的中性粒细胞可能起源于脑边界，但它们很可能是通过涉及CXCL2阳性细胞的趋化因子信号招募的。无论其起源如何，损伤部位的内皮是循环中性粒细胞接触的第一个位点，在其粘附、定位、激活和NETs形成中扮演关键角色。过氧化还原蛋白（PRXs），特别是PRX4，是关键的抗氧化酶，可消除高达90%的细胞内H₂O₂。内皮细胞特异性删除PRX4已被证明在CI/R模型中会恶化BBB破坏、增加微血管炎症，并加剧长期神经功能缺损和脑萎缩。这些发现突出了内皮细胞（ECs）中ROS清除的重要性，并表明其在预防NETs形成方面的潜力。

ROS可通过多种途径产生，包括NADPH氧化酶（NOX）、线粒体和芬顿反应。NOX已被确定为在缺氧/复氧（H/R）条件下ECs中ROS产生的主要贡献者。尽管NETs可由多种刺激诱导，但临床策略更常关注ROS清除而非直接抑制NOX。因此，抗氧化剂和铁螯合剂是靶向CI/R损伤期间NETs形成的有前景的治疗候选物。

基于这些考虑，我们假设由铁可用性调节的内皮ROS是CI/R期间NETs形成的关键驱动因素。为验证这一假设，我们研究了在H/R条件下，铁和ROS与维生素C（Vc）和甲磺酸去铁胺（DFOM）干预在ECs上NETs形成中的作用，并评估了Vc和DFOM在小鼠大脑中动脉闭塞和再灌注（MCAO/R）模型中的治疗效果。

2 材料与方法

本研究使用了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人髓系细胞系（HL-60）、小鼠脑血管内皮瘤细胞（bEnd.3）和小鼠主动脉内皮细胞（MAECs）。通过腺相关病毒（AAV）载体递送的shRNA沉默了MAECs中的铁转运蛋白（Fpn1）。从小鼠股骨和胫骨骨髓中分离出中性粒细胞，并使用SYTOX Green染色可视化NETs形成。通过覆盖PARAFILM? M膜诱导缺氧，并通过直接移除该膜实现复氧。

使用DCFH-DA评估细胞ROS水平。使用铁测定试剂盒测量总铁（Fe²⁺ + Fe³⁺）含量。通过将新鲜全血添加到预培养有MAECs或其匀浆的96孔板中来测量凝血时间。

使用RNeasy Kit从处理的MAECs中提取总RNA，并使用SYBR Green Super Mix进行定量PCR（qPCR）。使用放射性免疫沉淀裂解缓冲液从MAECs中提取蛋白质，并通过蛋白质印迹法分析目标蛋白表达。

所有动物实验均符合GB/T 35823-2018，并获浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准。对雄性C57BL/6J小鼠（6-8周龄）进行CI/R挑战，并随机分为四组：CI/R、Vc、DFOM和Vc + DFOM。通过MCAO/R诱导CI/R，并在再灌注前10分钟腹腔注射抗坏血酸（200 mg/kg）或甲磺酸去铁胺（100 mg/kg）。再灌注24小时后，收集全脑用于TTC染色和免疫荧光分析。

对每组三只小鼠的脑组织进行转录组测序，并进行生物信息学分析，包括基因集富集分析（GSEA）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。

数据以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 9.5进行单因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验或非配对t检验。p值<0.05被认为具有统计学显著性。

3 结果

3.1 NETs在复氧过程中的形成依赖于铁和ROS

NETs形成最初在缺氧的ECs上观察到，包括MAECs、HUVECs和bEnd.3细胞。在PMA刺激4小时后，与常氧对照相比，缺氧下的NETs水平降低，但在复氧后显著增加。这种复氧诱导的NETs形成被EDTA、DFOM和Vc处理减弱。相比之下，在中性粒细胞中，复氧期间观察到很少的NETs，并且NETs形成被EDTA、DFOM和Vc增加。使用SYTOX Green评估NETs，并通过CitH3蛋白水平的可比趋势确认了其可靠性。这些结果表明，NETs最初在复氧期间在缺氧的ECs上形成，并且该过程依赖于铁和ROS。

3.2 NETs形成受细胞外铁和ROS调节

为确定细胞内铁对NETs形成的贡献，沉默了Fpn1以抑制铁流出。沉默效率通过qPCR和蛋白质印迹确认。Fpn1沉默在缺氧或复氧后条件下均未显著改变细胞内铁水平。然而，在这两种条件下，Fpn1沉默细胞中的细胞外铁水平显著降低。引入红细胞（RBCs）和血红素作为缺氧下铁的可能来源。在sh-NC细胞中，添加铁或血红素并未增加ROS水平，而在sh-Fpn1细胞中，ROS降低并随后通过铁或血红素补充恢复。在Fpn1沉默的ECs上，NETs形成略有减少，但被不同形式的细胞外铁（包括与FeSO₄、RBCs或血红素共培养）逆转。这些发现表明，来自ECs的细胞内铁增强了ROS生成和NETs形成。

为评估抗氧化剂和铁螯合剂减少NETs和减轻CI/R的最佳给药时机，在复氧前5分钟或复氧后立即与中性粒细胞一起添加Vc或DFOM。Vc预处理显著降低了ROS水平，而复氧后添加的Vc和DFOM显示出可忽略的效果。有趣的是，与复氧后添加Vc相比，Vc预处理在减少NETs方面效果较差，并且DFOM未显著影响NETs形成。这些结果表明，细胞外铁和基线ROS协同增强ROS水平，从而在复氧期间促进NETs形成。

3.3 缺氧红细胞增强ROS生成并促进复氧期间的NETs形成

考虑到缺氧区域存在残留血液，我们探索了缺氧和复氧条件下血液与ECs之间的相互作用。在缺氧的sh-NC转染的MAECs中，在存在全血的情况下复氧导致约1分钟内快速凝血，该过程被Vc或DFOM处理延迟。在Fpn1沉默细胞中，凝血显著延长，但在Vc或DFOM处理后减少。在细胞匀浆实验中，sh-NC和sh-Fpn1组的凝血均被抑制。在缺氧前与RBCs共培养的sh-Fpn1 MAECs中，ROS水平略有降低，无统计学显著性，但在复氧期间添加DFOM时显著降低。有趣的是，NETs形成显示出相反的趋势：缺氧期间共培养的RBCs显著增加了NETs形成，该效应被DFOM进一步增强。这些结果突出了RBCs在H/R条件下对NETs形成的促进作用。

3.4 Vc和DFOM减少NETs以减轻小鼠CI/R损伤

在CI/R小鼠模型中评估了Vc和DFOM的体内效应。TTC染色显示，CI/R组的平均梗死体积为57.87%。单独使用Vc或DFOM治疗对减少梗死体积的影响有限（分别为49.54%和54.01%），而它们的联合使用导致显著减少至25.70%，这是典型的协同效应。通过CitH3和CD31免疫荧光可视化NETs和小血管存在。CitH3和CD31的共定位主要在未受影响的大脑半球观察到。在该区域，CitH3强度在各组中相对稳定，而CD31表达在DFOM组中降低，该效应在联合治疗组中部分逆转。在受伤半球，CitH3和CD31信号均响应DFOM而非Vc治疗而显著改变。CitH3和CD31的趋势在组织间基本一致，表明NETs形成与内皮状态密切相关，并可能解释联合治疗组中观察到的NETs抑制减少。结果支持抗氧化剂Vc与铁螯合剂DFOM可以减少NETs并协同减轻小鼠CI/R损伤。

对小鼠脑组织进行转录组分析，DEGs的热图显示，MCAO/R的效应被治疗逆转。在MCAO/R下高表达但在治疗后下调的基因与NETs形成相关，并可富集于诸如癌症通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、补体和凝血级联、白细胞跨内皮迁移和血小板激活等通路。相反，治疗上调的DEGs主要与昼夜节律、mTOR信号和自噬相关。在Vc与CI/R比较中，共鉴定出581个上调和567个下调基因；在DFOM与CI/R比较中，有620个上调和822个下调基因；在Vc + DFOM与CI/R比较中，有1487个上调和1838个下调基因。GSEA显示，大多数富集的GO术语被下调。具体而言，细胞大分子分解代谢过程、DNA结合和蛋白质分解代谢过程在Vc或DFOM治疗组中不显著，而在Vc + DFOM组中显著激活。另一方面，染色体、半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性和内切核酸酶活性在Vc或DFOM治疗组中显著，而在Vc + DFOM组中变得不显著。铁-硫簇结合和铁离子结合在Vc或DFOM治疗组中未显著富集，并且在Vc + DFOM组中的显著性降低。氧化还原酶活性在DFOM组中显著抑制，而在Vc + DFOM组中变得不显著。

也对KEGG进行了GSEA。结果表明，昼夜节律授时、谷氨酸能突触、GnRH分泌、催产素信号通路和蛋白酶体在Vc或DFOM组中未富集，而在Vc + DFOM组中显著富集。甘氨酸丝氨酸和苏氨酸代谢、Ras信号通路、Rap1信号通路、T细胞受体信号通路、耶尔森菌感染和血管内皮生长因子信号通路在VC或DFOM组中显著富集，而在Vc + DFOM组中变得不显著。具体而言，Hif-1信号通路在这些治疗中富集，支持氧化应激减少的存在。NET形成也显著抑制 across treatments，以及其相关通路如Fc gamma R介导的吞噬作用、血小板激活和补体和凝血级联。与组织染色结果一致，NETs相关通路在DFOM组中比在Vc + DFOM组中更显著富集。使用简单KEGG富集观察到类似结果。对富集于NET形成通路的DEGs进行了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，关键NETs相关基因如Cyba、Ncf1、Ncf4、Vwf、Syk、Itgb2和Card9存在于所有这些比较中。此外，C5ar1、Fcgr3、Plcg2和Cybb仅在Vc组中下调；Itgal、Hist1h2bp和Selp仅在DFOM组中减少；其他几个基因仅在Vc + DFOM组中降低，包括Mapk1、Mapk3、Itga2b、Prkca、Hdac7和Akt2。这些发现表明，Vc和DFOM均抑制卒中后NETs形成；然而，当两种治疗联合时，这种效应似乎部分减弱，尽管Vc和DFOM在减轻卒中方面 clearly act synergistically。

4 讨论

近年来，NETs已成为卒中发病机制的关键贡献者。在免疫细胞中，中性粒细胞是最先被招募到缺血损伤部位的细胞。这些浸润细胞通过产生ROS、蛋白酶和脂质运载蛋白-2以及形成NETs加剧脑损伤。卒中后，受损大脑释放大量HMGB1，激活RAGE和TLR4通路，将危险信号传递至周围组织。此外，JAK-STAT信号通路显著上调，促进炎症和水肿。HMGB1和JAK/STAT信号都是NETs的有效诱导剂。卒中中其他失调的因素，如神经元冷诱导RNA结合蛋白，也被证明可诱导NETs形成。通常，NETs形成被认为依赖于中性粒细胞衍生的ROS。然而，ROS也可以由缺血脑组织强力产生，特别是通过磷脂酶A2激活和脂质过氧化。组织源性ROS对NETs形成的影响仍不清楚。在本研究中，我们通过观察缺氧ECs表面的NETs确认了神经元ROS的促NETs效应。我们进一步证明铁增强了ROS产生，并且用DFOM和Vc靶向铁和ROS有效减少了NETs形成并减轻了小鼠MCAO模型中的CI/R损伤。

中性粒细胞响应损伤相关分子模式而激活，并通过滚动和粘附至内皮随后迁移而被招募到发炎组织。内皮功能障碍在卒中亚型中常见，并显著恶化临床结果。受损的ECs足以诱导NETs形成，并且也对NETs高度脆弱，NETs可破坏内皮屏障完整性并诱导细胞死亡。可能导致恶性循环，其中NETs和EC激活相互放大，促进血栓形成和继发性脑损伤。我们的研究结果支持内皮作为卒中再灌注后NETs形成的主要位点，可作为有价值的治疗靶点。我们观察到，与中性粒细胞相比，NETs更显著地由H/R处理的ECs诱导，突出了ECs在再灌注期间驱动NETs形成中的关键作用。卒中相关铁死亡，以脂质过氧化和铁积累为特征，促进了铁的输出和细胞外ROS产生。在富含铁的卒中后微环境中，ROS可以通过芬顿反应轻易产生，促进神经元细胞中的铁死亡和坏死性凋亡。Fpn1是唯一已知的细胞铁输出蛋白。在卒中模型中，内皮特异性Fpn1删除减少了脑铁和ROS水平，在急性期抑制了铁死亡。然而，长期Fpn1删除通过促进神经胶质增殖和阻碍修复而损害恢复。这些发现表明，在急性期直接靶向细胞外铁，而非靶向Fpn1本身，可能提供治疗益处。在我们的研究中，Fpn1敲低减少了ROS和NETs形成，该效应可通过铁或血红素补充恢复。DFOM和Vc在体外有效减少了ROS并抑制了NETs形成，尤其是在复氧前给药时。这些结果支持了细胞外铁和基线ROS在复氧期间协同放大氧化应激并促进NETs形成的概念。

缺血性卒中由脑血管内血管内凝血驱动。NETs可以交互促进血小板激活和凝血，从而加剧卒中、增强动脉粥样硬化和炎症，并导致对rt-PA溶栓的抵抗。在H/R损伤期间，ROS产生和NETs形成也受残留血液成分的影响。红细胞溶解在卒中发作后几分钟内开始并持续数天，释放血红蛋白、氧化血红蛋白、游离血红素和铁。这些铁形式可以穿透脑组织，促进毒性、氧化应激、炎症和谷氨酸介导的兴奋性毒性。我们的结果进一步支持了红细胞在CI/R期间NETs形成中的作用，特别是在挫伤区域。在体外，与RBCs共培养的ECs表现出对缺氧的部分抵抗，并且ROS生成在DFOM处理下显著降低。然而，NETs形成在这些共培养中增强，并被DFOM进一步增强。这种矛盾效应可能是由于RBCs释放的氧气或铁-DFOM复合物保留的催化活性。即使在低于正常血糖水平达到0.1 mM时，ECs也可以保持在低耗氧率，这是氧气运输所必需的。因此，我们处理中的RBCs可以作为缺氧下ECs的氧气库。另一方面，DFOM可以减少任何浓度下的过氧化抑制ROS生成。5 mM DFOM的处理（远高于本研究中的水平）完全消除了bEnd.3细胞中氧葡萄糖剥夺后复氧（OGD/R）诱导的氧化损伤。这可以解释与RBCs孵育后ROS抑制的增强。DFOM的铁螯合也被报道促进人血源性中性粒细胞中的NETs形成，该过程依赖于NADPH和肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）。因此，DFOM和RBCs处理对NETs形成的增强可能是由从RBCs（一个丰富的铁库）中螯合铁诱导的。尽管如此，DFOM和RBCs在体外诱导NETs的能力是适度的，并且DFOM对NETs的明显抑制在CI/R小鼠中得到进一步确认。

Vc和DFOM先前已被报道减轻CI/R损伤并减少NETs形成。例如，全身施用Vc改善了MCAO大鼠的梗死体积、BBB完整性和神经元存活，并与减少的ROS/活性氮物种和炎症相关。Vc单独或与其他抗氧化剂组合已显示在体外以剂量依赖性方式抑制LPS诱导的NETs形成。铁超载驱动铁死亡和坏死性凋亡，并且DFOM在H/R模型中已证明对这些过程具有保护作用。镰状细胞病患者中升高的血清铁和血红素也促进NETs形成和炎症，该效应可通过DFOM治疗减少。DFOM作为铁载体，清除铁并防止中性粒细胞中的ROS生成。然而，DFOM也被报道在某些条件下促进NETs形成，可能是由于螯合铁复合物的残留ROS生成能力。通过组织学染色和生物信息学分析在体内进一步验证了Vc和DFOM的效应。引人注目的是，Vc和DFOM仅适度减少了梗死体积，并且联合给药显著减少了梗死体积，表现为“协同效应”。通过组织学染色，DFOM显著抑制了MCAO小鼠中的NETs形成。然而，与DFOM组相比，Vc + DFOM组中的NETs抑制不太明显，尽管生物信息学表明单独使用Vc或DFOM均显著抑制了NETs形成。结果表明，Vc和DFOM在改善CI/R方面可能具有其他交互效应，例如在联合治疗组中增强或废除的通路。尽管Vc和DFOM对NETs形成的抑制并未一致地表现出更强的抑制，但它们的效应可能是互补的。例如，血管平滑肌（VSM）收缩在Vc或DFOM组中均未显著富集，但根据KEGG富集，在联合治疗组中显著抑制。这可能解释了联合治疗组中NETs形成抑制减少的部分原因，因为减少的VSM收缩可能增强缺血后的再通，如显著减少的梗死体积所支持，这暴露了更多的损伤ECs，为NETs形成提供了更大的界面。重要的是，由CitH3指示的NETs形成趋势与内皮标志物CD31高度一致，支持了NETs与内皮状态之间的密切联系。已知CD31在缺氧下减少；在我们的研究中，它不受Vc影响但被DFOM降低。在联合治疗组中，CD31水平与Vc组相当，可能反映了缺氧减少。由于CD31促进中性粒细胞迁移至炎症部位，它也可能通过增强中性粒细胞与受损神经元之间的相互作用促进NETs形成。

本研究确认了靶向ROS以抑制NETs形成和减轻CI/R损伤的治疗潜力，既通过抗氧化剂（Vc）直接清除ROS，也通过使用铁螯合剂（DFOM）防止芬顿反应产生ROS。然而，应承认某些局限性。培养的ECs中使用的H/R模型可能无法完全复制卒中期间ECs、铁、ROS和中性粒细胞之间复杂的体内相互作用。对于MCAO模型，通过 filament withdrawal 实现了慢性低灌注而非完全再灌注。这可能很好地反映了卒中情况，同时大量ECs仍处于缺氧状态，这对药物递送、ROS积累和NETs形成是不可能的。因此，NETs形成能力可能被低估，尤其是在模型组中。在几个测定中观察到的高组内变异性表明，需要更精细的方法或更严格的实验控制来进一步证实这些发现。Vc和DFOM联合治疗显著改善了神经元梗死，但未能在体内增强NETs形成的抑制。这表明它们的增强效应可能依赖于超越ROS和NETs的机制，需要充分阐明。

5 结论

在H/R下内皮上NETs的形成依赖于ROS和细胞外铁。Vc和DFOM联合给药协同减轻了MCAO小鼠的脑损伤，至少部分通过降低铁和ROS水平以及抑制NETs形成。鉴于DFOM和Vc是临床可用的药物，它们在卒中治疗中的再利用值得进一步的临床前研究，尤其是使用精细的H/R模型和更长期的结局评估。