衰老相关分泌表型（SASP）对内皮细胞调控的机制研究及其在老年软组织愈合中的关键作用

本综述深入探讨了衰老成纤维细胞（NHDF）通过复制性衰老（replicative senescence）形成的衰老相关分泌表型（SASP）及其与微血管内皮细胞（HDMEC）的相互作用机制。研究揭示了衰老细胞在软组织愈合中的双重角色：早期短暂出现可能有益，但持续存在会导致慢性炎症和组织纤维化。文章重点分析了衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）、细胞周期调控蛋白（P21/P38）及细胞因子（IL-6/MCP-1）的表达变化，为改善老年组织修复提供了新的分子靶点和治疗策略。

　　

1 引言

随着人口老龄化加剧，老年软组织愈合障碍已成为临床面临的重大挑战。人类软组织愈合的两个主要影响因素是伴随疾病和细胞衰老，这两者都随着年龄增长而累积。在西方国家老年人口增加的背景下，深入了解衰老在肉芽组织修复过程中的功能变得至关重要。本研究旨在验证衰老的经典标志物，如衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）和衰老相关分泌表型（SASP）在成纤维细胞衰老过程中的发展。通过使用连续传代作为复制性衰老诱导剂的体外模型，揭示了单培养中非衰老（non-s）和前衰老（pre-s）成纤维细胞表型的特异性差异，为详细研究这些表型与微血管内皮细胞在共培养中的相互作用奠定了基础。

软组织创伤后，正常愈合依赖于一个精心编排的级联事件以确保组织替代。然而，除了伴随疾病外，尤其是高龄可能会阻碍愈合，导致慢性伤口形成。虽然伤口愈合在早期生活中相当简单，但肉芽组织的形成和伤口闭合随着年龄增长而延迟，愈合障碍在老年人中是一个普遍现象。尽管已有 established 的治疗方案，但由于难以适应伤口个体化和独特的特性，这些方案受到限制。

衰老细胞，通常被称为衰老相关分泌表型（SASP），是老年生物体的常规组成部分。在软组织愈合中，这些细胞的作用一直存在争议。一方面，它们似乎阻碍愈合，主要是由于其促炎特性；但越来越多的知识表明，当它们在修复过程中短暂出现时具有积极功能。可以想象，这种作用在愈合早期阶段可能特别有利，而由于SASP增强的生存潜力导致的慢性化则引发负面后果，包括组织纤维化和癌症。

软组织愈合的增殖期特征是通过参与细胞（如组织成纤维细胞和内皮细胞）的 vigorous 相互作用形成肉芽组织。成纤维细胞确保适当的组织稳定性和张力，提供细胞外基质（ECM）蛋白，并且是表达α-平滑肌 actin（α-SMA）的肌成纤维细胞（MF）的来源，后者在血管发育和促进愈合中具有主要重要性。由于肉芽组织的质量对愈合结果至关重要，并且其在老年机体中的发育延迟，因此成纤维细胞在衰老过程中发生的功能变化可能产生巨大影响。成纤维细胞与内皮细胞的相互作用对愈合过程中的血管生成至关重要。在常规肉芽组织中，微血管内皮细胞对于功能性血管网络的重建至关重要。此外，慢性伤口与血管疾病相关，甚至在一定程度上由其引起，因此内皮细胞的重要作用变得明显。

允许证据表明衰老对软组织愈合影响的模型有限。由于监管障碍和患者群体的广泛个体伴随疾病谱系导致的难以比较的同质性，通过临床试验进行的体内研究仍然困难。在这里，我们修改了一个现有的体外共培养模型，该模型已在软组织愈合的背景下应用，以使用具有年龄差异的成纤维细胞，这些细胞通过连续传代和复制性衰老产生。

2 材料与方法

2.1 连续细胞传代

从幼年供体获得的原代人真皮成纤维细胞（NHDF）使用不含抗生素的成纤维细胞生长培养基（FGM）培养，其中含有10%胎牛血清（FCS）。从体外传代（P）4开始，对细胞进行连续传代。确定的接种数量与传代过程中测量的数量使得能够计算世代时间和（累积）群体倍增数。通过相差显微镜记录细胞形态。剩余的细胞作为冷冻存档储存在液氮中。当培养20天内未发生群体倍增时，我们在P44停止细胞培养。

由于预期从一个传代到下一个传代的细胞特征会发生细微变化，我们定义了三个组，将"前衰老（pre-s）培养物"组的任意截断点设在P34，这刚好是从该传代开始平均细胞直径保持大于20μm的传代。另一个细分产生了"非衰老（non-s）培养物"（P5-P17）和"过渡中培养物"（trans；P18-P33）组。

2.2 通过CASY细胞计数器表征成纤维细胞

在连续传代过程中，使用细胞计数器（CASY Model TT Cell Counter + Analyser System）测定细胞数量、直径和存活率。

2.3 通过衰老相关β-半乳糖苷酶表征成纤维细胞

为了量化NHDF的SA-β-gal，应用了稍加修改的测定方案。简而言之，SA-β-gal数量通过微孔板读数器测量4-甲基伞形酮的荧光强度，并与总蛋白量相关。

从冷冻存档中制备非衰老（P8-P9）和前衰老NHDF（P39-P42）的单培养物，用于SA-β-gal染色试剂盒。20个视野用于计算SA-β-gal阳性细胞的比率。

2.4 成纤维细胞与内皮细胞通过细胞间接触的相互作用

为了验证具有不同年龄的NHDF对内皮细胞的特征性反应，我们使用了直接（细胞间接触）和间接（条件培养基）设置。因此，使用来自两个幼年供体的人真皮微血管内皮细胞（HDMEC），在含有5% FCS的内皮细胞生长培养基MV（ECG-MV）中培养，并用于P5-P9。

对于直接共培养，从冷冻存档中扩增非衰老（P8-P9）和前衰老（P39-P42）NHDF，然后（t-24小时）与HDMEC以80 cells/mm²和160 cells/mm²的密度在共培养培养基（CKM；一份FGM和一份ECG-MV，7.5% FCS）中接种在预处理过的玻片上。对于每次重复，额外平行制备NHDF和HDMEC的单培养物。让细胞再增殖24小时（第0天）和72小时（第2天），然后固定样品进行免疫细胞化学染色。收集细胞培养上清液用于酶联免疫吸附测定（ELISA）。

2.4.1 免疫细胞化学染色

免疫染色用于将细胞区分为von Willebrand因子（vWF）阳性HDMEC和vWF阴性NHDF。α-SMA的表达表明NHDF的MF分化。通过Ki-67抗体测定细胞周期G0期外的细胞比率。使用含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的培养基进行核复染和封片。

2.4.2 定量显微镜

使用配备Axiovision软件的Axioskop 2进行定量显微镜检查，40个视野用于确定细胞数量和群体密度，而通过评估20个视野确定Ki-67和α-SMA阳性NHDF的百分比。

2.5 成纤维细胞与内皮细胞通过条件培养基的相互作用

间接共培养用于验证由HDMEC条件培养基传递给非衰老（P8-P10）和前衰老NHDF（P41-P43）的旁分泌效应。在t-48小时，将NHDF和HDMEC的单培养物以相应密度接种在 referring 培养基中。在t-24小时更换为CKM后，HDMEC在24小时内产生条件培养基；非条件CKM作为对照。将NHDF暴露于条件和非条件CKM中再培养48小时，然后进行细胞计数和RNA分离。储存细胞培养上清液用于ELISA。

2.5.1 定量实时聚合酶链反应

来自非衰老和前衰老NHDF的总RNA，无论是在非条件还是条件培养基中培养，都用于逆转录和基因表达分析。为了获得基因表达数据与研究其他分析数据的实质性关联基础，包括了广泛的衰老相关基因，代表了不同细胞功能的大范围：P16、P21、P38和P53编码对细胞周期调控重要的蛋白质，而VIM编码波形蛋白，一种主要的细胞骨架丝蛋白。编码对组织愈合具有高度相关性的ECM蛋白的基因，如纤连蛋白和胶原蛋白，由FN1、COL1A1和COL3A1代表。此外，来自细胞因子和生长因子组的基因，即白细胞介素（IL）-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和血管内皮生长因子（VEGF）在炎症背景下进行分析。参考基因为GAPDH。

2.6 酶联免疫吸附测定（ELISA）

在直接和间接设置的细胞培养上清液中，通过Quantikine ELISA Human试剂盒分析IL-6和MCP-1的浓度。使用微孔板读数器测量吸光度。通过Magellan Software计算细胞因子浓度。

2.7 数据组和统计评估

为了识别三个组之间的显著差异，我们使用了单因素方差分析（ANOVA）和在未给定正态性的情况下的秩和ANOVA。对于两个组之间的差异，我们应用了学生t检验（在未给定正态性的情况下使用Mann-Whitney秩和检验，在未给定等方差的情况下使用Welch's t检验）。图表中的值以个体数据点给出，并带有均值和标准差（SD）。

3 结果

3.1 通过连续传代实现成纤维细胞的前衰老

NHDF的相差显微镜显示早期传代中典型的纺锤形形态，而随着传代进展，出现越来越多具有更大细胞表面的细胞。在晚期传代中，培养表面经常存在细胞残留物。就每代群体倍增数而言，增殖从P5的1.86下降到P43的0.40，此时NHDF最终经历了总共44次累积群体倍增。通过CASY测定的平均细胞直径随着传代显著增加，而平均存活率下降。前衰老培养物组中的SA-β-gal值增加。这些数据清楚地验证了通过连续传代产生前衰老NHDF表型。经典标志物SA-β-gal在冷冻储存期间得以保留，表明前衰老培养物中阳性NHDF的比率更高。

3.2 前衰老NHDF的增殖较弱，但不受HDMEC限制

在单培养中，反映2天内增殖的非衰老NHDF密度增加，而检测到前衰老NHDF的增殖显著较弱。在单培养中观察到的非衰老NHDF的强烈增殖在共培养中被HDMEC限制，而这种效应在前衰老NHDF中未出现。

就细胞周期中非静止期G0的循环细胞比率而言的增殖数据表明非衰老和前衰老NHDF之间没有差异：在单培养中，第0天和第2天Ki-67阳性NHDF的比率非常相似。然而，在共培养中，HDMEC的存在在第0天趋势上抑制了循环NHDF的比率。细胞周期的重新启动发生在第2天。

3.3 肌成纤维细胞的存在在前衰老NHDF中减少且不受HDMEC触发

通常，α-SMA阳性NHDF在第0天达到最大值，并随时间下降。有趣的是，前衰老NHDF在第2天显示出比非衰老培养物更低的MF比率。对于非衰老NHDF，在第2天，HDMEC的存在可以触发MF的比率，但在前衰老NHDF中则不能。

3.4 前衰老NHDF的细胞因子释放表明SASP的发展

单培养和共培养的IL-6水平直到第2天下降。在与HDMEC的共培养中，所有测量值都处于较高范围。在这方面，额外制备的HDMEC单培养仅微弱释放IL-6，因此似乎对共培养中的总IL-6释放不起主要作用。前衰老NHDF在第2天的单培养中显示出比非衰老NHDF更高的IL-6值。这清楚地表明前衰老培养物中SASP的发展。

在单培养中，MCP-1水平随时间下降直到第2天。与非衰老NHDF相比，前衰老NHDF在第2天释放更多MCP-1，表明SASP的发展。早期时间点前衰老NHDF中较低的MCP-1水平可能暗示初始细胞粘附过程中的应激水平较低。同样，所有测量值在与HDMEC的共培养中处于较高范围。HDMEC在单培养中的MCP-1释放意味着在共培养中大多数MCP-1来源于HDMEC而非NHDF。

3.5 基因表达谱表明非衰老和前衰老NHDF中的 distinct 调控

非衰老和前衰老NHDF基因表达的比较产生了明显趋势：在缺乏HDMEC影响的非条件培养基生长情况下，与前衰老NHDF相比，前衰老NHDF显示细胞周期调节因子P21的表达增加，而P16、P38和P53处于相似范围。VIM在前衰老NHDF中上调，而所有ECM相关基因-FN1、COL1A1和COL3A1-下调。在细胞因子/生长因子基因中，尤其是MCP-1和VEGFA在前衰老NHDF中显示更高表达。IL-6和IL-8处于相似表达水平。

3.6 非衰老和前衰老NHDF对HDMEC条件培养基显示不同反应

对条件培养基的基因表达变化在当前设置中处于较低水平。然而，观察到的趋势的解释，无论某个基因是上调还是下调，都用于表明非衰老和前衰老NHDF之间基因调控的一般差异。

HDMEC的条件培养基稳定了前衰老NHDF中的P21和P38。对VIM基因表达没有影响。在前衰老培养物中，ECM基因稳定，而非衰老NHDF显示COL1A1和COL3A1下调。细胞因子/生长因子基因在两个NHDF组中类似地调控：IL-8表达被触发，VEGFA表达被抑制，而IL-6和MCP-1没有明显变化。然而，HDMEC对IL-6和MCP-1基因表达偏转方向的影响不同：虽然非衰老NHDF以IL-6和MCP-1基因的轻微下调响应，但前衰老NHDF显示更异质性的响应，导致IL-6和MCP-1的轻微上调。因此，通过ELISA更详细地查看相应蛋白质的释放是合理的。

3.7 非衰老和前衰老NHDF的细胞因子释放不受HDMEC修改

IL-6和MCP-1蛋白质的释放在两个NHDF组中未明显受HDMEC条件培养基影响。然而，这些额外数据支持从直接相互作用设置获得的第2天数据，其中IL-6和MCP-1在前衰老NHDF中处于较高水平。尤其是较高的前衰老NHDF MCP-1值再次表明SASP的发展。

4 讨论

正如预期的那样，NHDF群体倍增随着传代进展持续减少。前衰老培养物显示出现衰老的特征性迹象，例如存活率下降、SA-β-gal增加、由于P21上调导致的弱增殖以及细胞尺寸增加。由于大细胞尺寸是衰老的典型标志，很明显，这些细胞可能不再有助于增殖，因为强烈的细胞周期检查点控制和受损的细胞骨架功能。

前衰老NHDF显示培养表面上的残留物，类似于文献中称为"痕迹"的现象。在这里，"痕迹"可能反映了细胞迁移和突起缩回过程中一般细胞体灵活性的某种丧失，表明前衰老NHDF与非衰老NHDF相比具有增加的粘附潜力。在这方面，在前衰老NHDF中检测到波形蛋白的趋势性上调，这是增大的衰老成纤维细胞的已知特征，再次表明影响粘附行为的修饰细胞骨架组成。

将这些特征转化为 developing 肉芽组织的体内情况表明，前衰老表型的存在是不利的，并导致无活力的组织。相比之下，功能性肉芽组织在非衰老NHDF的基础上通过 regular 细胞增殖、存活率、形态和尺寸发展。前衰老NHDF中SASP特征，如直接相互作用模型中单培养中已存在的炎症标志物IL-6和MCP-1所示，导致这样的假设：前衰老NHDF对肉芽组织中的微环境具有相当严重的旁分泌影响。因此很明显，出现和持续存在的促炎SASP可能阻碍愈合并支持慢性伤口。

此外，我们从数据中得出结论，前衰老NHDF向MF的分化受损可能是组织 destabilization 的主要原因，导致老年人脆弱的肉芽组织。MF负责组织收缩，并在常规愈合过程中提供重要的ECM蛋白，因此缺乏MF直接解释了稳定性的缺失。前衰老NHDF的基因表达通过低水平的FN以及COL1A1和COL3A1支持这一假设。COL1A1和COL3A1的下调先前已显示与衰老成纤维细胞有关。

由于通过血管修复、血管生成和血管整合重建功能性微血管系统对于肉芽组织的性能至关重要，我们通过将HDMEC直接和间接接触非衰老和前衰老NHDF来关注血管区域中发生的事件。HDMEC对非衰老和前衰老NHDF有不同的影响：在HDMEC附近，非衰老NHDF无法达到在相应单培养中存在的这种增殖。然而，由于静止在细胞周期G0期的细胞数量对于非衰老和前衰老NHDF相似，这种增殖抑制可能不是由于G0期 arrest。

将这些结果转化为体内情况意味着，微血管内皮细胞限制肉芽组织中过度成纤维细胞增殖的能力可能反映了一种机制，通过该机制可以限制主要由成纤维细胞提供的总细胞质量。这在软组织愈合的增殖期向重塑期过渡期间似乎很重要，以确保新形成和修复的血管功能整合到成熟组织中。在这方面也值得提及的是，Mayrand等人已经描述"细胞数量的强烈增加可以抑制毛细血管形成。"

这种HDMEC的限制效应在前衰老NHDF的情况下似乎不是必要的，因为前衰老NHDF在与HDMEC接触时未显示强烈增殖，主要是由于维持高P21水平。P21上调可通过控制G1/S和G2/M的检查点导致细胞周期损伤，并导致保护衰老细胞免于死亡。足够有趣的是，前衰老NHDF还通过上调P38响应HDMEC。因此，并结合体内情况，通过P38在G1/S和G2/M的细胞周期调控可能额外支持受损的增殖。

尤其是前NHDF中MCP-1和IL-6的稳定表达表明老年人体内微血管的巨大影响。除了促炎细胞因子的存在外，位于血管附近的衰老成纤维细胞的VEGFA下调和 reinforcing FN、COL1A1和COL3A1基因表达可能阻碍微血管形成及其 proper 整合到组织中，导致受损愈合。

此外，前衰老NHDF中MF的永久缺乏可能 account for disturbed 血管生成和血管化重建，因为MF"为血管发育提供有利环境"。在我们的模型中，对于非衰老NHDF，MF分化被HDMEC触发。相比之下，前衰老NHDF未以这种方式响应HDMEC，表明 disregulated 细胞通讯，可能由随着年龄发生的MF自我激活特性丧失所支持。

5 结论

NHDF在该模型中的特征性行为支持当前对细胞衰老在组织修复中有益和有害作用的理解，并提供了与内皮细胞 delicate 相互作用的新结果和视角。结果对于解释肉芽组织中发生的体内过程具有高度相关性，特别关注血管区域。在非衰老NHDF中注意到HDMEC的增殖抑制，而前衰老NHDF通常显示较弱的增殖，最可能由维持P21和P38水平引起。除了前衰老NHDF培养物中出现"痕迹"，表明细胞灵活性的某种丧失外，还检测到SASP特征，包括有限的存活率、增加的细胞尺寸和炎症标志物的存在。前衰老NHDF向MF的分化率较低，且不能被HDMEC触发。因此，假定前衰老NHDF在组织稳定、血管生成和血管化重建方面存在严重功能缺陷。

关于成纤维细胞具有衰老表型在愈合后期持续存在的现象，这些细胞与血管部位内皮细胞的局部相互作用可能部分导致其清除效率低下。这一方面应成为那些为老年人设计的软组织愈合未来研究的一个组成部分。