厌氧消化从低负荷中温到高负荷高温的转变：反应器性能与微生物组的演替规律

本刊推荐：本研究通过基因组解析宏基因组学深入揭示了污水污泥厌氧消化（AD）从37°C中温（Mesophilic）向55°C高温（Thermophilic）转变并逐步提高有机负荷率（OLR）过程中，微生物群落结构、功能潜能与反应器性能的联动机制。研究识别出304个物种水平基因组箱（SGB），发现186个与高温条件相关，并鉴定出多个新型物种参与关键功能（如互营乙酸氧化SAOB）。结果表明，高温启动初期由氢营养型（Methanothermobacter spp.）和乙酸裂解型（Methanosarcina thermophila）产甲烷古菌及互营丙酸氧化菌（如Pelotomaculaceae）主导；高效产气阶段则由单一氢营养型甲烷杆菌与互营乙酸氧化菌（Thermacetogenium phaeum等）协同主导；高OLR导致功能恶化时，水解类群更替且乙酸裂解型古菌再度出现。该研究为优化污泥厌氧消化工艺提供了重要的微生物生态学见解。

　　

1 引言

厌氧消化（AD）是处理污水污泥实现卫生化、减量化和资源化的常用技术。该过程依赖微生物群落降解复杂有机物并产生以甲烷和二氧化碳为主的沼气。消化过程由多个功能互赖的微生物类群协同完成，主要包括水解（水解颗粒性有机底物）、产酸发酵（将氨基酸、碳水化合物和脂质转化为有机酸和醇）、产乙酸（将有机酸和醇进一步降解为乙酸、H₂、甲酸盐和CO₂）以及产甲烷（将H₂/甲酸盐和CO₂或乙酸转化为甲烷）四个步骤。丁酸盐和丙酸盐等降解产物在低浓度下才热力学有利，因此产丙酸或丁酸的细菌与氢营养型产甲烷古菌之间的互营关系至关重要。乙酸可通过乙酸裂解型产甲烷古菌直接转化，但在高温和高氨氮条件下，互营乙酸氧化（SAO）途径（将乙酸氧化为H₂/甲酸盐和CO₂，再由氢营养型产甲烷古菌利用）变得更为重要。

温度是决定厌氧消化器性能和微生物群落结构的关键因素。处理污水污泥的大型消化器通常在中温（约35°C）或高温（约55°C）条件下运行。高温操作的主要优势是水解速率约为中温条件下的两倍，因此理论上可提高污泥降解率和沼气产量，从而允许处理更大流量的污泥并缩短停留时间。此外，高温操作还能更好地灭活微生物病原体（包括真核生物、细菌和病毒）。然而，高温消化也面临一些运行挑战，例如稳定性较差、更易受到氨抑制和酸化影响。铵在蛋白质降解过程中释放，并与氨处于平衡状态，后者对整个过程有抑制作用。乙酸裂解型产甲烷古菌比互营菌和氢营养型产甲烷古菌更容易受到抑制。氨平衡随温度升高而向氨倾斜，导致高温过程更容易出现问题。温度和氨水平都是微生物群落结构和多样性的强效调节因子，其值增加时多样性降低。高温和/或高氨水平还会影响不同功能微生物类群的相对重要性。例如，如前所述，在高温和高氨水平下，与乙酸裂解型产甲烷作用相比，互营乙酸氧化耦合氢营养型产甲烷作用通常更为普遍。

用于处理污水污泥的高温厌氧消化器的启动通常使用中温污泥，特别是在污水处理厂（WWTP）已有中温消化器的情况下。中温污泥向高温条件的转变导致微生物群落组成发生剧烈变化，并通常伴随沼气产量的暂时下降。几种温度变化策略已被测试，快速直接升温似乎比逐步转移能更快恢复反应器性能。然而，温度升高的速率实际上受消化器加热能力的限制。如果温度变化的目的是提高处理能力，则向高温条件的转变将伴随有机负荷率（OLR）的增加。增加的OLR已知会影响产生的挥发性脂肪酸（VFA）的浓度和组成以及微生物群落的组成和结构。过高的OLR还可能导致反应器失效。以往关于从中温向高温操作转变和/或增加OLR对厌氧消化器微生物组影响的研究通常侧重于通过16S rRNA基因测序分析分类组成和多样性，而利用基因组解析宏基因组学研究微生物组功能潜能变化的工作尚缺乏。此外，目前尚不清楚在温度转变阶段出现的高温类群是否与在最佳负荷条件下高温操作中最终主导的类群相同。

本研究考察了从市政污水处理厂中温污泥启动的高温厌氧消化器中反应器功能和微生物群落组成的时间变化。反应器在热适应阶段和随后的逐步增加有机负荷率（OLR）期间均受到监测，且游离氨浓度保持稳定。这种受控设置使我们能够分离温度和负荷对微生物和功能转变的影响。采用鸟枪法宏基因组测序获取反应器在300天运行期间26个时间点上细菌和古菌的分类组成和功能潜能信息。功能分析包括AD过程中的不同代谢步骤，即水解、厌氧氧化、硫酸盐还原和产甲烷作用，这些可与反应器性能相关联。该研究为污水污泥消化器在高温适应和负荷转变过程中微生物群落的生态和代谢重组提供了见解。

2 实验方法

2.1 厌氧消化器系统

半生产规模的消化器系统建于瑞典的K?ppala污水处理厂，包括一个缓冲罐（1.2 m³）、一个称重罐（0.4 m³）、一个消化器（5 m³）、一个储气罐和一个火炬。初级污泥（占底物质量的65%）和废弃活性污泥（35%）的混合物从主污水处理厂泵入缓冲罐。缓冲罐中的部分污泥混合物通过称重罐每小时一次泵入消化器。称重罐能够精确测量喂入消化器的底物质量。污泥中的总固体（TS）含量为5.2% ± 0.3%，TS中的挥发性固体（VS）分数为81% ± 2%。总有机碳含量为22.0–24.4 g L^?1，总氮含量约为2.4–2.8 g L^?1，总脂肪含量为5.2–7.3 g L^?1。

2.2 实验活动

实验活动分为8个阶段。阶段1是从中温到高温的温度转变，通过在7天内将温度从37°C线性升高到55°C来实现。该阶段还包括在目标温度下低OLR初始运行34天，以避免在污泥适应高温条件期间超负荷。在阶段2，OLR增加至2.3 ± 0.1 kgVS m^?3 d^?1，这与污水处理厂全规模中温消化器的OLR相似。该OLR维持了三个水力停留时间（HRT）。在阶段3-8，OLR逐渐增加至11.1 ± 0.3 kgVS m^?3 d^?1，相应地将HRT逐步减少至约4.1天。OLR的增加分步进行，持续7天，以避免消化器超负荷。两个例外是从阶段6到7的变化，分步进行持续14天，以及从阶段7到8的变化，一步完成。每个阶段，OLR水平至少维持三个HRT，除阶段8稍短。

2.3 计算

HRT使用Takács等人提出的固体停留时间方法动态计算。用于接种高温试验反应器的中温厌氧消化器的HRT为18天。因此，起始HRT设为18天，然后使用方程（1）为实验的每一天递归近似HRT。OLR是添加的有机物质（即kg VS）质量每立方米反应器每天。OLR使用方程（2）计算。VS去除效率使用方程（3）计算。游离氨浓度使用方程（4）计算。

2.4 分析方法

消化器系统中的在线测量和控制包括温度；污泥和消化物的质量；消化器中的超压；沼气中的CH₄、CO₂、H₂S和O₂水平；以及沼气流量。其他分析方法，如挥发性脂肪酸（VFA）、碱度、铵（即TAN）、TS、VS、泡沫和pH测量，按数据S1中的说明进行。

2.5 DNA提取与测序

从反应器收集了26个时间点的污泥样品。样品在-20°C保存直至DNA提取，使用FastDNA Spin Kit for Soil进行。除额外的均质化步骤外，遵循制造商的方案。DNA测序由Eurofins Genomics进行，文库制备使用基于NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina的方案，并在NovaSeq 6000平台上进行双端2×150碱基对（bp）测序。原始序列读数保存在NCBI SRA，生物项目为PRJNA973019。

2.6 生物信息学

使用SingleM和MetaPhlan4对微生物群落组成进行初步的基于读长的分析。将SingleM输出在属水平分组，使用基于希尔的多样性指数1计算样本间的成对相异性，并进行主坐标分析（PCoA）以可视化样本间群落组成的差异。另一个使用MetaPhlan4输出的PCoA显示出相似的模式。基于PCoA，将样本分为四组。对每组样本进行重叠群组装和分箱，步骤包括：（1）使用fastp进行质量过滤；（2）使用BBNorm标准化至目标深度100和最小深度2；（3）使用Megahit和meta-large预设进行组装；（4）使用Bowtie将每个样本的读长映射到重叠群，使用Samtools，使用Metabat、BinSanity和Vamb进行分箱；（5）使用DASTool确定一致箱。将所有四组样本的箱合并，并使用dRep以0.95的平均核苷酸一致性（ANI）阈值去重复。去重复的箱可视为物种代表。为了进一步细化箱，使用Anvio检查完整性和冗余性。手动使用anvi-refine优化高完整性（>90%）但高冗余（>5%）的箱。使用MetaWrap中的reassemble_bins模块，利用所有26个样本的序列读长重新组装低完整性（<90%）但低冗余（<5%）的箱。最后，使用CheckM和Anvio检查所有箱的完整性和冗余性（污染）。保留完整性>50%且冗余性<10%的箱用于进一步分析。使用GTDB-TK和数据库R207确定箱的分类归属。

使用CoverM和bwa-mem作为映射软件确定箱的相对丰度。如果箱中少于50%的核苷酸被至少一个读长覆盖，则将该箱在样本中的相对丰度设为0。

使用Prokka预测和注释箱的编码序列（CDS），它使用Prodigal确定翻译CDS的氨基酸序列。还通过Interproscan和通过使用DIAMOND中实现的BLASTP查询翻译的CDS氨基酸序列与参考序列进行功能注释。将分类群分类为推定产乙酸菌、互营乙酸氧化菌（SAOB）、互营丙酸氧化菌（SPOB）、硫酸盐还原菌（SRB）和产甲烷古菌的标准，以及用于识别参与产甲烷、Wood-Ljungdahl、甘氨酸裂解、甲基丙二酰辅酶A和异化硫酸盐还原途径的基因的基因注释和数据库登录号列在数据S2中。为了识别编码负责多糖、脂质和多肽水解的酶的基因，使用了CAZ、脂酶工程v4.1.0和MEROPS数据库。对于CAZ数据库，使用CAZy-Parser下载糖苷水解酶、多糖裂解酶和碳水化合物酯酶的序列。对于MEROPS数据库，手动去除肽酶抑制剂。

使用Phylophlan构建系统发育树。从NCBI下载参考基因组组装。系统发育树以Methanopyrus kandleri作为外类群进行根定，并使用ete3或pyCirclize绘制。使用FastANI计算平均核苷酸一致性（ANI）。

2.7 统计方法

使用FastSpar估计箱间出现的相关性，该软件基于SparCC算法，并使用Scipy计算Spearman的ρ。使用NetworkX构建和分析网络，基于FastSpar和Spearman均显著的成对相关性（p < 0.05）且相关系数>0.5。

使用方程（5）计算样本中水解基因的加权平均分数。

3 结果

3.1 反应器性能

在阶段1的温度转变期间，体积甲烷产量从第2天的0.42 Nm³ m^?3 d^?1迅速下降到第8天的0.06 Nm³ m^?3 d^?1。由于设备故障，OLR在第10天至第21天之间为零。一旦底物投加恢复，甲烷产量从0.03逐渐增加到阶段2相对稳定的0.51 ± 0.6 Nm³ m^?3 d^?1。在阶段3-8，体积甲烷产量随着OLR的增加而增加。比甲烷产率（归一化到喂入反应器的VS质量）在阶段4达到峰值0.31 ± 0.06 Nm³ kg^?1VS_in，此时OLR为3.5 ± 0.9 kgVS m^?3 d^?1，HRT接近11.3天。在阶段7-8，比甲烷产率下降至0.23 ± 0.02 Nm³ kg^?1VS_in，此时OLR和HRT分别接近11.3 kgVS m^?3 d^?1和4.0天。先前关于污水污泥高温厌氧消化的研究发现，最佳比甲烷产率出现在OLR约2.5–3.7 kgVS m^?3 d^?1，性能在高于7.5 kgVS m^?3 d^?1时恶化。

VS去除率在阶段1当HRT高且OLR低时达到峰值68%。在阶段2，它接近50%，随后增加OLR的各阶段平均值在44%–48%范围内。总VFA浓度在反应器启动后的初始样本中很高，在第6天达到3.1 gHAc L^?1。然后，VFA浓度保持稳定直到最后阶段，从阶段7的1.5 ± 0.3 gHAc L^?1增加到阶段8的3.1 ± 0.3 gHAc L^?1。然而，碱度足够高，在整个实验过程中保持稳定的pH值7.0–7.3。乙酸是主要的VFA，浓度通常在1.0 g/L左右，除阶段1和8外，浓度超过3.0 g L^?1。丙酸盐和异戊酸盐在阶段1和8检测到浓度分别高达1.1 g L^?1和0.4 g L^?1。TAN浓度从阶段1的1.8 gN L^?1下降到阶段3-8的1.0–1.2 gN L^?1，表明随着OLR增加，蛋白质降解效率下降。类似地，游离氨浓度从阶段1的峰值0.2 gN L^?1下降到阶段1和阶段3-8的0.04–0.07 gN L^?1。相比之下，产生的气体中H₂S比例从阶段4开始随着OLR增加逐渐增加。阶段1也可观察到一些高值。H₂S在含硫蛋白质降解过程中产生，并通过硫酸盐还原菌（SRB）的活性产生。泡沫在阶段4末在反应器中观察到，并持续到实验结束。实验结束时的H₂S水平和起泡问题随着OLR增加而增加。超负荷和OLR波动被报道为全规模厌氧消化器起泡的最常见原因，因为表面活性物质等有机化合物的积累。

3.2 微生物群落结构

3.2.1 适应高温条件过程中多样性降低

对图1所示时间点收集的26个样本进行测序，组装出304个物种水平基因组箱（SGB），代表了61%–74%的序列读长。在这些SGB中，109个可分类为高质量草图宏基因组组装基因组（MAGs），完整性>90%且冗余性<5%（根据CheckM和Anvio）；182个为中等质量草图MAGs，完整性>50%且冗余性<10%（根据Bowers等人建议的报告标准）；13个为低质量，完整性<50%或冗余性>10%（根据其中一种质量控制方法）。关于SGB的详细信息，包括大小、重叠群数量、N50、完整性、冗余性和分类归属，显示在数据S1中。

反应器中的物种多样性计算为希尔数，顺序为1（¹D）。整个群落的多样性从实验开始时的72下降到阶段3的15。然后逐渐再次增加，最终达到28。组装和分箱无关的方法SingleM和Metaphlan4显示出与组装SGB分析相同的α和β多样性模式。

3.2.2 网络分析揭示微生物群落演替

所有304个SGB均包含在网络分析中，揭示了三个主要模块。每个模块可视为一个共现分类群的子群落。模块1包括99个SGB，在第一个采样点占群落的50%，但迅速下降到第76天小于1%。模块2包括118个SGB，相对丰度从第6天的8%迅速增加到第83天（阶段2）的62%。该模块中的SGB然后逐渐下降到实验结束时的22%。模块3包括68个SGB，在阶段3第139天之前占群落的不到6%。然后，它们逐渐增加相对丰度，在实验结束时达到47%。有19个SGB无法放入网络模块。它们代表了群落的次要部分，在第一个采样点相对丰度为2%，然后在其他采样点在0.3%到1.1%之间。因此，网络分析显示了实验期间三个主要子群落之间的演替。

3.2.3 网络模块的微生物群落组成

三个网络模块的微生物群落组成如图所示。模块1包含在高温适应期间被灭活并逐渐从反应器中洗出的中温分类群。它具有高多样性，几个门，包括Cloacimonadota、Desulfobacterota、Fermentibacterota、Spirochaetota和Verrucomicrobiota，仅在模块1中发现，并且先前在中温厌氧消化器中观察到。模块2-3包含高温分类群，多样性低于模块1。在细菌中，与模块1相比，模块2-3在Actinobacteriota、Proteobacteria和Firmicutes内有更多SGB。古菌的多样性在模块1中很高，检测到来自三个门（Halobacteriota、Methanobacteriota、Thermoproteota）的七个SGB。模块2有三个古菌SGB，属于Halobacteriota和Methanobacteriota，而模块3只有一个属于Methanobacteriota。

三个模块中九个最丰富的SGB如图所示。只有三个可以在物种水平上进行分类分类。模块1中的Candidatus Fermentibacter daniensis (KM55)已知在污水处理厂的中温厌氧消化器中丰富，可能有助于将糖发酵成乙酸和氢气。模块2中的Coprothermobacter proteolyticus (Km244)在第3阶段达到30%的相对丰度。这是一个已知的高温物种，在其他处理污水污泥的高温厌氧消化器中观察到。该物种降解肽和一些糖，主要产生乙酸、H₂和CO₂作为产物。模块3中的Dictyoglomota thermophilum (KM256)、另一个Dictyoglomaceae sp. (KM237)和一个Fervidobacterium sp. (KM49)在实验结束时迅速增加相对丰度。Dictyoglomota门包含极端嗜热成员，模式菌株D. thermophilum是糖解菌，发酵各种碳水化合物主要生成乙酸、乳酸、H₂和CO₂。最丰富的SGB还包括模块1中的Smithellaceae sp. (Km3)和Prolixibacteraceae sp. (KM19)，模块2中的Firmicutes E sp. (KM192)，以及模块3中的Methanothermobacter sp. (Km228r)。后者在模块3中在第5阶段达到20%的相对丰度。

3.3 物种代表基因组箱（SGB）的功能分析

使用基因注释和系统发育分析，鉴定了推定参与水解和发酵、互营丙酸氧化、产乙酸作用、互营乙酸氧化、硫酸盐还原和产甲烷作用的分类群。

3.3.1 水解与发酵

通过注释为编码CAZymes、脂酶和肽酶的基因识别参与多糖、脂质和多肽水解的微生物。除四个Methanobacteriota spp.外，所有SGB均包含水解基因。计算每个SGB中水解基因的比例，并确定每个样本中水解基因的加权平均比例。CAZyme基因的比例最初从第6天的1.4%下降到阶段3-5的0.7%，但在阶段8又增加到1.6%。脂酶的比例在阶段1达到峰值4.6%，在阶段3-5下降到3.8%–4.0%，然后在阶段8又增加到4.6%。肽酶的比例从第6天的2.7%增加到阶段2的3.3%，之后逐渐下降到阶段8的2.9%。先前的研究表明，微生物组中水解基因的组成随着饲料组成的变化而变化。在这里，它似乎通过温度变化和高温条件下OLR的增加而改变。

在模块1中，主要的水解和发酵分类群包括一个Smithellaceae sp. (Km3)和一个Anaerolineae (KM72)，两者都具有高比例的脂酶基因，以及一个Prolixibacteraceae sp. (KM19)，其在SGB中具有最高比例的CAZyme基因。Smithellaceae科包含几个已知降解短链脂肪酸的物种。在模块2中，主导的Coprothermobacter proteolytica (Km244)具有低比例的CAZyme基因，但就肽酶基因含量而言位于SGB的前3%。该分类群已知是蛋白水解的，并已在高温厌氧反应器微生物群落结构的多项研究中被识别。模块2中其他丰富的分类群包括一个Firmicutes E sp. (KM192)，就肽酶含量而言位于前1%，以及一个Limnochordia sp. (KM261)，其在所有三组水解基因中都具有相当高的基因比例。Microthrix parvicella (KM249)和另一个Microthrix sp. (Km109)也分别在模块2和3中丰富。两个物种都具有高比例的脂酶基因。在模块3中，一个Fervidobacterium sp. (KM49)就CAZyme含量而言属于SGB的前四分之一。Fervidobacter是众所周知的水解分类群。Dictyoglomota thermophilum (KM256)和Dictyoglomaceae sp. (KM237)就脂酶和肽酶而言属于前四分之一，就CAZymes而言属于前10%，这与D. thermophilum作为糖解嗜热菌的认知一致。

3.3.2 互营丙酸氧化

丙酸是发酵过程中的中间体，其积累可能表明过程失败。高温厌氧消化器比中温消化器更常遭受高丙酸盐浓度的影响。通过分类归属到已知包含SPOB的科或属，以及甲基丙二酰辅酶A（mmc）途径所有步骤的基因存在，分析了SPOB的存在。推定SPOB的相对丰度在阶段1迅速下降。模块1有15个SGB分类为推定SPOB。这些包括三个Smithellaceae spp.和四个Syntrophosphaera spp.，已知包含SPOB，并与中温条件相关。主导的Smithellaceae sp. (Km3)也被分类为水解细菌，因为其高比例的脂酶和肽酶。Ca. Syntrophosphaera thermopropionivorans (Km269)在中温污泥中也具有高相对丰度，但在阶段1温度升高期间从反应器中消除。该物种先前在一个高温丙酸氧化反应器中被识别，但其他Syntrophosphaera spp.已与中温条件相关联。Smithella属以及Cloacimonadaceae的代表，例如Syntrophosphaera，是污泥基过程中常见的潜在丙酸降解菌。

在模块2中，最丰富的推定SPOB均未在物种水平上被识别。最丰富的分类群是一个细菌（KM79），在GTDB中具有占位符物种名称DTU030 sp012842325。它属于Smithellaceae科，并先前已从厌氧消化器中组装出来。KM108被分类为Pelotomaculaceae spp.，这是一个已知包含在高温条件下繁殖的SPOB的科，并且也在升高的氨水平下（即1.2 g NH₃ L^?1）。在模块3中，一个分类为Thermanaerothrix daxensis (Km304)的SGB，属于Anaerolineae纲，最为丰富，在第6阶段达到0.7%的相对丰度。该物种是已知的嗜热厌氧菌，发酵糖。然而，其他Anaerolineae物种已从丙酸降解高温环境中分离出来，尽管尚未被识别为丙酸氧化菌。一个Kapabacteriales sp. (KM58)，在GTDB中具有科级占位符UBA2268，但属水平未分类，达到0.3%，并在比甲烷产率最高的时期出现在反应器中，并与主导的产甲烷古菌（Km228r）共存。该SGB还具有甲基丙二酰辅酶A途径中的所有基因，包括一个注释为丙酸CoA转移酶的基因，该基因在许多其他推定SPOB中缺失。据我们所知，这是关于该目中潜在丙酸氧化菌的首次报道。然而，该物种属于Bacteroidota门，已知包含许多丙酸生产者，因此其在当前反应器中的作用无法断定。

3.3.3 产乙酸作用与互营乙酸氧化

先前的研究表明，高温厌氧消化中的乙酸转化可以通过互营乙酸氧化耦合氢营养型产甲烷作用而不是乙酸裂解型产甲烷作用来完成。反向过程，同型产乙酸作用，在功能良好的消化器中不是主导过程，但可能在低温和低或高pH下发生。几项研究假设SAOB使用Wood-Ljungdahl途径，在某些情况下与甘氨酸裂解途径耦合。然而，基于该途径分析，很难完全阐明检索到的候选者是乙酸氧化菌还是乙酸生产者，因为已知的SAOB和产乙酸菌都已被证明单独使用Wood-Ljungdahl或与甘氨酸裂解途径结合使用。

基因注释在模块1、2和3中分别识别出23、25和15个具有Wood-Ljungdahl单独或与甘