H2S介导GH3.1巯基化调控IAA稳态促进刺槐不定型根瘤形成与固氮的分子机制

本研究揭示了气体信号分子H2S通过巯基化修饰GH3.1蛋白Cys304位点，抑制其酶活性，减少IAA-Asp/IAA-Glu结合物生成，维持活性IAA水平，从而促进刺槐（Robinia pseudoacacia）与根瘤菌共生过程中不定型根瘤的形成和氮（N）固定能力。该发现为木本豆科植物-根瘤菌共生体系的氮高效利用提供了新的调控靶点和理论依据。

　　

H₂S增强刺槐氮吸收与生长能力

外源施加100 μM NaHS（H₂S供体）显著提高了接种根瘤菌的刺槐植株的地上部和根部干重，同时增加了叶片叶绿素含量和全氮积累。H₂S处理还显著提高了根瘤数量和固氮酶活性，尤其在接种后26–50天效果最为明显。这些结果表明H₂S在刺槐-根瘤菌共生系统中具有促进植物生长和氮营养吸收的双重作用。

H₂S促进根瘤菌侵染与结瘤基因表达

通过荧光标记根瘤菌（Mesorhizobium amorphae GS0123-GFP）侵染过程的观察发现，H₂S处理加速了根毛卷曲、侵染线形成和皮层细胞中根瘤菌的定殖。定量分析显示，H₂S显著诱导了早期结瘤基因如ENOD40、NIN、NUP133、LHK、CCaMK和CYCLOP的表达，表明H₂S在分子水平上调控了共生信号的识别与转导。

H₂S调控不定型根瘤发育的多阶段进程

利用AzMC荧光探针检测发现，H₂S在根和根瘤中含量显著上升，尤其是在根瘤原基和分生区域。H₂S同时上调了内源H₂S合成基因DCD和DES1的表达，表明其可通过正反馈循环维持H₂S稳态。半薄切片和透射电镜结果进一步显示，H₂S处理扩大了根瘤的固氮区域（Z3），并促进了类菌体的分化与共生体膜的完整性。

转录组分析揭示H₂S调控IAA代谢与信号通路

根与根瘤的转录组分析表明，H₂S显著影响植物激素信号转导、代谢途径和次级代谢物合成通路。H₂S处理上调了ARF1和GH3.1等生长素相关基因的表达，并降低了IAA-Asp和IAA-Glu等结合型IAA的含量，表明H₂S可能通过调节IAA代谢维持其活性水平。

H₂S与IAA互作调控根瘤形成与固氮

外源IAA处理抑制了根瘤形成和固氮酶活性，而H₂S处理缓解了这一抑制效应。激素定量显示，H₂S显著降低结合型IAA水平，维持游离IAA含量，从而促进根瘤发育。同时，IAA也能诱导H₂S的积累和DES1表达，表明两者之间存在正反馈调节机制。

Cys304位点巯基化抑制GH3.1活性

序列比对和进化树分析显示，刺槐GH3.1蛋白在多个半胱氨酸位点（包括Cys304）高度保守。体外实验证明，H₂S以浓度依赖的方式巯基化GH3.1蛋白，质谱分析进一步确认Cys304是关键的修饰位点。点突变实验（C304A）显著降低了巯基化水平，并增强了GH3.1的酶活，表明该位点对H₂S的调控至关重要。结构预测显示，Cys304位于GH3.1活性中心附近，其巯基化可能引起局部构象变化，进而影响酶活。

讨论与机制模型

H₂S通过巯基化GH3.1的Cys304位点，抑制其催化活性，减少IAA的氨基酸结合，维持活性IAA水平。较高的IAA水平进一步促进DES1表达和内源H₂S合成，形成正反馈循环。H₂S与IAA共同上调ENOD40等结瘤基因，促进根瘤菌侵染、不定型根瘤形成和氮固定。该研究阐明了H₂S通过翻译后修饰调控植物激素稳态的新机制，为木本豆科植物的共生固氮提供了重要的理论依据和应用潜力。