BnaC04.bZIP16通过BnaA06.SnRK2介导的磷酸化负调控甘蓝型油菜脂肪酸积累的分子机制

本研究发现甘蓝型油菜（Brassica napus）转录因子BnaC04.bZIP16通过直接结合脂肪酸合成关键基因BnaA08.OLEOSIN1和BnaC03.PDH-E1 BETA的启动子区域，负调控种子脂肪酸积累。研究首次揭示SnRK2激酶（BnaA06.SnRK2）通过磷酸化修饰BnaC04.bZIP16蛋白的Ser151位点，削弱其DNA结合能力和蛋白稳定性，从而解除对脂肪酸合成基因的抑制。该研究为作物油脂代谢调控网络提供了新机制（bZIP家族、磷酸化、G-box motif），为油菜高油分子育种提供了重要靶点。

　　

分子特性与功能验证

研究团队通过生物信息学分析在甘蓝型油菜基因组中鉴定出6个bZIP16同源基因，其中BnaC04.bZIP16在发育中的长角果和种子中呈现高表达特征。该蛋白包含392个氨基酸残基，具有典型的碱性亮氨酸拉链结构域和G亚家族特有的三个保守序列，符合bZIP转录家族的典型特征。亚细胞定位实验证实BnaC04.bZIP16-eGFP融合蛋白特异定位于细胞核内。

功能研究显示，在拟南芥中过表达BnaC04.bZIP16导致种子总脂肪酸含量降低5%-25%，其中不饱和脂肪酸下降尤为显著。在甘蓝型油菜Westar品种中获得的过表达株系（OE-BnaC04.bZIP16）种子脂肪酸含量降低15%-17.9%，而通过CRISPR-Cas9技术构建的敲除突变体（KO-BnaC04.bZIP16）脂肪酸含量显著增加12.9%-19.7%。脂肪酸组分分析表明油酸（C18:1）含量变化最为明显。这些结果表明BnaC04.bZIP16是脂肪酸积累的负调控因子。

靶基因调控机制

CUT&Tag分析揭示BnaC04.bZIP16在基因组上的结合峰有62.93%位于基因启动子区域， motif富集分析发现CACGTG（G-box）为核心结合序列。GO分析显示靶基因显著富集于种子发育、碳水化合物代谢和脂肪酸生物合成等生物学过程。

研究人员筛选出10个脂肪酸代谢相关候选靶基因，双荧光素酶报告系统检测发现BnaC04.bZIP16对BnaA08.OLEOSIN1和BnaC03.PDH-E1 BETA等基因的启动子具有显著抑制作用。qRT-PCR分析证实，在OE-BnaC04.bZIP16株系中，BnaA07.WRI1、BnaC02.FUS3、BnaC03.ABI3、BnaA08.OLEOSIN1和BnaC03.PDH-E1 BETA等脂肪酸合成关键基因的表达均显著下调。

分子互作验证实验表明，BnaC04.bZIP16通过直接结合BnaA08.OLEOSIN1和BnaC03.PDH-E1 BETA启动子区的G-box motif（CACGTG）发挥调控作用。染色质免疫共沉淀（ChIP）、酵母单杂交（Y1H）和电泳迁移率变动分析（EMSA）等实验均证实了这一直接结合关系。功能研究表明，过表达BnaA08.OLEOSIN1和BnaC03.PDH-E1 BETA分别使种子脂肪酸含量增加13%-23%和13%-20%。

磷酸化调控机制

免疫共沉淀（IP）结合免疫印迹实验发现BnaC04.bZIP16蛋白在体内发生丝氨酸磷酸化修饰。LC-MS/MS分析鉴定出Ser151为关键磷酸化位点，该位点在多个物种中高度保守。互作蛋白筛选发现BnaA06.SnRK2（BnaA06g22800D）与BnaC04.bZIP16存在相互作用，该激酶与拟南芥AtSnRK2.5（AT5G63650）具有高度同源性。

表达模式分析显示BnaA06.SnRK2与BnaC04.bZIP16在种子发育前期呈现高度一致的表达趋势。亚细胞定位表明BnaA06.SnRK2主要定位于细胞核和细胞质，与BnaC04.bZIP16的定位存在部分重叠。分裂荧光素酶互补、双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交（Y2H）实验均证实了两者之间的直接互作。

体外激酶实验证明BnaA06.SnRK2能够磷酸化BnaC04.bZIP16，而将Ser151突变为丙氨酸（S151A）后磷酸化水平显著降低。EMSA分析发现，随着磷酸化程度增加，BnaC04.bIP16与BnaA08.OLEOSIN1启动子的结合能力逐渐减弱。

蛋白稳定性研究表明，BnaA06.SnRK2介导的磷酸化促进BnaC04.bZIP16通过泛素/26S蛋白酶体途径降解。在野生型背景中BnaC04.bZIP16蛋白半衰期为20分钟，而在OE-BnaA06.SnRK2背景中缩短至10分钟。模拟持续磷酸化状态的BnaC04.bZIP16^S151D突变体蛋白半衰期同样显著缩短，且亚细胞定位由细胞核变为核质共存。

生物学功能验证

在甘蓝型油菜中过表达BnaA06.SnRK2并不改变BnaC04.bZIP16的转录水平，但显著上调BnaA08.OLEOSIN1和BnaC03.PDH-E1 BETA的表达水平。相应地，OE-BnaA06.SnRK2株系种子脂肪酸含量增加至少20%，其中油酸（C18:1）含量变化最为显著。

研究最终提出"BnaA06.SnRK2-BnaC04.bZIP16-BnaA08.OLEOSIN1/BnaC03.PDH-E1 BETA"调控通路模型：BnaC04.bZIP16通过直接抑制下游靶基因表达负调控脂肪酸积累；BnaA06.SnRK2通过磷酸化BnaC04.bZIP16的Ser151位点，减弱其DNA结合能力和蛋白稳定性，从而解除对脂肪酸合成基因的抑制，最终促进种子脂肪酸积累。

该研究首次揭示了bZIP转录因子G亚家族成员在油脂代谢中的负调控功能，阐明了SnRK2激酶通过磷酸化修饰调控转录因子活性的新机制，为甘蓝型油菜高油分子育种提供了重要的理论依据和基因资源。