利用氧化海藻酸盐微凝胶实现快速自组装牙体组织器官的体外与体内再生

本综述系统介绍了氧化海藻酸盐（OA）微凝胶在牙体组织再生中的突破性应用。该材料通过快速自降解特性促进高密度牙源性干细胞（hDSCs）的自发凝聚和上皮-间质相互作用（EMI），成功构建了具有功能化血管网络和骨组织分化的生物工程牙胚模型，为颅颌面再生医学提供了可即时移植的支架-free解决方案。

　　

引言

颅颌面组织缺损的再生修复面临组织结构紊乱和细胞连接不足的挑战。传统生物支架常因残留引发免疫排斥，而细胞悬液移植又难以重建复杂三维结构。本研究创新性地利用氧化海藻酸盐（OA）微凝胶负载高密度人牙源性干细胞（hDSCs），通过模拟发育过程中的细胞自发凝聚和上皮-间质相互作用（EMI），实现功能性牙体组织的原位再生。

OA微凝胶的制备与表征

通过高碘酸钠氧化处理未改性海藻酸盐（UA），在尿醛酸单元C-2和C-3位形成二醛基，使聚合物骨架在水性环境中易发生水解断裂。¹H-NMR谱图在5ppm处出现的新质子峰证实了二醛基的成功引入，且氧化程度越高峰值越显著。流变学测试显示OA具有剪切稀化特性，其表观粘度排序为：UA > 1OA > 2OA > 5OA。值得注意的是，2%UA与4%2OA、1%UA与2%5OA具有相近粘度，因此研究采用加倍OA浓度以匹配UA的物理化学特性。

降解动力学研究表明，5OA微凝胶在5天内完全降解，而UA组仅轻微膨胀但仍保持圆形结构。钙离子依赖性实验证实：在CaCl₂中微凝胶保持完整，在PBS中则快速降解。这种可控降解特性解决了传统生物材料滞留体内阻碍组织整合的难题。

hMSCs-TERT细胞封装优化

采用滴注-交联技术封装人端粒酶逆转录酶永生化间充质干细胞（hMSCs-TERT），细胞密度为1.0×10⁸ cells/mL。5OA组在培养第1天即启动细胞凝聚，第5天形成高密度细胞聚集体；而UA组始终维持溶胀状态且无细胞凝聚现象。活死染色显示5OA组细胞存活率显著高于其他组，这归因于凝聚微环境缩短了代谢物扩散距离，增强物质交换效率。

双微球融合实验证明5OA微凝胶具有自发整合能力：第1天开始界面融合，第5天完成完全整合，且保持区室化结构。这种融合能力对重现组织-组织相互作用（如EMI）具有重要意义，为牙齿等器官发育提供关键技术支持。

SCAP细胞的凝聚与融合

采用牙根尖乳头干细胞（SCAP）进行验证实验。5OA/SCAP组在第2天形成细胞凝聚体，第5天完全降解并形成球形细胞聚集体；UA组则始终维持离散细胞分布。番红O染色显示UA组残留藻酸盐被染成亮橙色（羧基显色），而5OA组无材料残留。

双球融合实验表明：5OA/SCAP在5天内完成完全融合，H&E染色显示细胞紧密排列；UA组因藻酸盐残留阻碍融合。Hoechst/PI染色证实5OA组细胞存活率极高，这得益于SCAP本身对缺氧环境的高度适应性。

体内移植验证

将牙周韧带干细胞（PDLSC）负载的微凝胶移植至小鼠皮下。术后2天，5OA组完全降解并与宿主组织整合；UA组则保持完整结构且可被完整取出。组织学分析显示：5OA组形成PDLSC凝聚体并与小鼠结缔组织、肌肉组织整合；UA组残留藻酸盐阻碍细胞-宿主整合。

三周观察发现：5OA组出现大量宿主微血管浸润（CD31阳性），而UA组存在无细胞空隙。经2周成骨诱导培养后移植，5OA组显示胶原沉积和血管浸润，OCN阳性细胞数较原生组提高15倍，血管密度增加4.2倍。这种"降解-激活"范式实现了降解、血管化和分化的同步进行。

牙胚模型构建

从胚胎14.5天小鼠下颌磨牙牙胚中分离上皮（EPI）和间充质（MES）细胞。RT-qPCR验证：上皮细胞高表达Pitx2，间充质细胞高表达Msx1。将5OA封装的两类细胞共培养形成EPI+MES组装体。

形态学分析显示：间充质细胞形成致密凝聚体，上皮细胞形成松散聚集体。DiI/DiO双标记实验证实：第1天边界模糊，第3天启动融合，第5天完成广泛融合。重要的是两类细胞保持区室化分布，维持EMI所需的信号交流环境。

肾囊移植实验

将组装体移植至小鼠肾囊，2周后分析：胚胎牙胚组形成完整牙结构（牙髓、牙本质、釉质、牙周韧带）；5OA组装体组形成骨样组织（矿化基质、胶原纤维、骨小梁）；细胞悬液组仅形成松散结缔组织。

免疫荧光显示：牙胚组和5OA组均出现CD31阳性血管和OCN阳性基质；细胞悬液组几乎无血管生成。冷冻切片原位杂交证实Pax9在MES区室表达，免疫荧光显示E-cadherin特异表达于EPI区室。

机制与优势

该系统的核心优势在于：①通过快速降解为细胞凝聚提供时空控制；②保持上皮-间充质区室化利于EMI信号交换；③微凝胶初期提供机械支撑利于移植操作；④促进血管浸润和细胞分化同步进行。与传统胶原凝胶支架相比，5OA系统无需长时间预培养和酶解处理，且避免动物源材料风险。

应用前景

该技术不仅适用于牙再生，还可推广至其他上皮-间充质相互作用的器官（如唾液腺）。通过调节细胞密度和降解速率，未来有望构建具有牙冠、牙根和牙周膜的完整生物工程牙齿。其可扩展性和成本效益为高通量药物筛选提供新平台。