全水相分离集成电化学适体生物传感器实现SARS-CoV-2刺突蛋白的皮摩尔级检测

本刊推荐：本研究创新性地将液相-液相相分离（LLPS）技术与电化学适体生物传感器（E-AB）相结合，克服了传统适体亲和力（KD）在微摩尔-纳摩尔级的限制，成功将SARS-CoV-2刺突蛋白检测灵敏度提升至皮摩尔（pM）水平。通过聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEX）体系实现靶标蛋白的定向富集与分子拥挤效应增强，无需多步信号放大即可实现100倍灵敏度提升，为即时检测（POC）诊断提供了突破性解决方案。

　　

引言

电化学适体生物传感器（E-AB）通过单链DNA适体的分子识别功能检测特定生物标志物，并将结合信号转化为电信号输出。与传统检测方法如定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）或侧流免疫分析相比，E-AB具有高特异性、快速响应、成本效益高的设备制造以及实时连续测量能力等优势，这些特性对于大规模社区筛查和诊断至关重要。

然而，E-AB在临床和社区检测中的应用仍受限于检测灵敏度不足以及人体生物体液中生物标志物浓度过低的问题。传统适体筛选方法（SELEX）获得的典型适体其解离常数（K_D）通常在纳摩尔至微摩尔亲和力范围内，而早期感染阶段人类唾液中SARS-CoV-2刺突（S）蛋白等模型生物标志物的存在浓度仅为皮摩尔（pM）级别，远低于已识别适体的亲和力。因此，现有的E-AB可能无法达到所需的临床灵敏度。尽管已有研究报道采用多聚体适体设计来提高对S蛋白三聚体的结合亲和力，但当前的研究重点仍集中在开发通用的下游信号放大策略，以克服采用单体ssDNA适体时的检测障碍。虽然使用导电纳米材料、DNA纳米技术或电化学晶体管实现了超灵敏检测，但增加的成本和检测复杂性往往不利于即时检测（POC）应用。因此，迫切需要一种单步信号放大方法，以增强E-AB作为未来大流行控制的快速POC解决方案。

本研究展示了一种称为液相-液相相分离（LLPS）的新型样品浓缩机制，作为上游信号放大解决方案与E-AB结合，实现了对2019冠状病毒病（COVID-19）S蛋白的皮摩尔级灵敏度检测。LLPS由两种水溶性和生物相容性聚合物——聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（DEX）组成的 aqueous 溶液引发。当聚合物浓度超过临界阈值时，由于聚合物-聚合物相互作用主导了混合熵，会自发分离成两个 aqueous 相。每一相具有独特的物理化学性质，并对S蛋白表现出差异化的溶剂化能，促使S蛋白优先迁移到特定相中以最小化总自由能。这种分配行为增加了S蛋白的局部浓度。此外，浓缩的聚合物溶液创建了一个类似于细胞内基质的大分子拥挤环境。拥挤试剂的存在已被证明可以增强酶性能以及配体与分析物之间的结合，进一步提高了酶促E-AB的灵敏度，并改善了靶标蛋白的捕获效率。LLPS在15分钟内富集蛋白质生物标志物，同时保持适体识别的生物活性。通过实时显微成像和酶联寡核苷酸测定（ELONA）证实了S蛋白向DEX富集部分的分配。设计了一种利用适体SNAP1.50的基于过氧化物酶的夹心E-AB来量化S蛋白。成功的S蛋白富集使E-AB灵敏度提高了100倍以上，并达到了低pM检测限。虽然LLPS在诊断中不常用，但这项研究是首次将LLPS集成到E-AB中并展示了先进灵敏度的报告，具有大流行控制的潜力。

结果

实时显微荧光成像显示刺突蛋白的分配行为

制备了由PEG和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖）组成的全水相液滴。 upon 干燥和溶剂蒸发，发生自发相分离。从明场图像中可以看出，分散的小液滴从边缘形成并合并到中心区域。同一液滴的荧光图像显示，在时间0时绿色荧光均匀分布， upon 相分离，可以观察到随着时间的推移，液滴内绿色荧光的富集。由于绿色荧光仅来源于FITC-葡聚糖聚合物，因此得出结论这些液滴是富含葡聚糖的区室。将Alexa Fluor 488 S蛋白加入相同的液滴配方中，但使用没有荧光标记的葡聚糖。结果显示相同的相分离行为，其中绿色荧光在开始时均匀分布，但自发相分离成边缘的微小液滴，最终在中心合并。这些结果证实了刺突蛋白定位于并浓缩在富含葡聚糖的区室中。

比色酶联寡核苷酸测定（ELONA）

进行了比色ELONA以量化刺突蛋白在富含葡聚糖相中的富集情况。将9:1体积比的两相混合物加入S蛋白，并分别提取富含PEG和富含葡聚糖的部分。通过比较有和没有LLPS时各相的吸光度强度，发现LLPS后，S蛋白浓度在DEX富集相中高出11倍（p < 0.05），在PEG富集相中低两倍（p < 0.05）。结果与实时成像实验的观察结果一致，即S蛋白优先从富含PEG层迁移到富含葡聚糖层。DEX富集相中的信号放大（11倍）也与从两相体积比估计的理论浓缩因子（即10倍）相匹配。这一转化实验进一步证明了LLPS通过富集刺突蛋白来放大检测信号输出的功效。

用于刺突蛋白检测的电化学适体生物传感器的表征

电化学适体生物传感器以其快速的信号转导效率和设备小型化而闻名。LLPS可以有效地浓缩来自基质（如唾液、汗液和尿液）中的生物标志物，这些基质中的目标物通常以痕量存在，而没有适当信号放大方法的生物传感器可能无法检测到它们的存在。因此，我们将这种分离LLPS方法与电化学适体生物传感器相结合，开发了一种简单快速的SARS-CoV-2刺突蛋白POC诊断 assay。

刺突蛋白的检测需要适体SNAP1.50、刺突蛋白和抗刺突蛋白辣根过氧化物酶修饰抗体（抗 Spike HRP-Ab）之间的夹心结合，随后与氢醌（HQ）和过氧化氢（H₂O₂）进行催化电化学反应。将适体SNAP1.50固定在金电极上，以捕获来自LLPS富集的样品中的S蛋白。随后，孵育抗 Spike HRP-Ab以形成夹心三联体。当三联体与底物（5 mM H₂O₂和5 mM HQ）作用时，发生一系列催化反应。信号生成仅在所有组分都存在时介导，而缺少任何组分导致最小甚至没有信号。

优化了刺突蛋白孵育时间以缩短检测时间，这对POC应用至关重要。将S蛋白样品与适体固定电极孵育0至2小时。当目标蛋白孵育30分钟时，检测产生显著更高的阳性信号（p < 0.05），并在1小时后达到平台期。进一步孵育没有导致显著的信号改善。通过进一步的实验优化，有可能在不到30分钟内实现快速蛋白质捕获。我们随后进行了表征，采用1小时的目标孵育时间以获得最佳信号输出。

虽然非目标蛋白也可能有利地分配到富含葡聚糖相中，但适体和抗体以其高特异性结合其同源目标。通过以下特异性研究证明了这一点。针对潜在的干扰蛋白测试了E-AB的特异性，包括SARS-CoV-2核衣壳蛋白、人免疫球蛋白G（IgG）、人血清白蛋白（HSA）和溶菌酶。这些蛋白质要么与COVID-19感染生物学相关，要么天然存在于人体生物体液中，并可能引起潜在的表面生物污染。与所有其他非目标蛋白相比，S蛋白产生了显著更高的响应，即使其浓度远高于目标蛋白。这模拟了潜在的共分配效应，并表明对夹心E-AB识别没有干扰。电极制造程序足以通过6-巯基-1-己醇（MCH）和牛血清白蛋白（BSA）封闭来减轻非特异性生物污染。

然后表征了优化的E-AB原型对一系列刺突蛋白浓度（无LLPS）的灵敏度。观察到刺突蛋白从1到200 nM的线性结合响应。基于3.3 × S_E/回归斜率，估计无LLPS样品预处理的E-AB的检测限（LOD）约为8 nM。总体而言，我们的结果表明E-AB原型可以高特异性和灵敏度检测S蛋白。估计的E-AB灵敏度可能足以检测处于COVID-19感染严重阶段患者的S蛋白。然而，根据病毒载量量化研究推断，早期发病患者的病毒蛋白可能以亚纳摩尔水平存在。

将LLPS集成到E-AB中

我们将LLPS集成到E-AB原型中以克服临床灵敏度不足的问题。我们修改了两种聚合物的浓度比，使得在平衡时，富含PEG与富含DEX的水相体积比为99:1。因此，我们预计刺突蛋白将在富含DEX的部分浓缩100倍。将不同浓度的S蛋白加入LLPS中， resulting 富含DEX相提取物通过E-AB进行测量。与没有LLPS的灵敏度校准相比，预处理组表现出从10 pM到2 nM的线性响应，估计LOD为55 pM。与未经预处理的传感器LOD（8 nM）相比，LLPS将刺突蛋白检测提高了150倍。这超过了根据指定的两相体积比的理论蛋白质富集因子所预期的（100倍）。虽然局部富集驱动的蛋白质浓度增加仍然是灵敏度提高的主导因素，但认为富含葡聚糖相通过创建分子拥挤环境模拟了细胞内基质。我们先前已经证明，这种拥挤诱导的排除体积效应增强了酶活性，控制了关键细胞活动，如分离-关联（SA）液滴形成和核酶活性。当前研究进一步证实了LLPS在基于酶的生物传感应用中的益处。虽然传感器的动态范围是评估E-AB性能的常用参数，但预计感染个体早期的刺突蛋白水平较低，在皮摩尔范围内。因此，比较灵敏度和LoD估计为通过LLPS集成实现痕量蛋白质检测提供了关键证据。

接下来，我们研究了改变体积比对E-AB信号改善的影响。从相图可以看出，通过选择同一系线（tie-line）上的组成，可以制备不同体积比（红点）的LLPS。由于系线与双节曲线（binodal curve）的截距（黑色和灰色矩形）决定了相分离时两相中的聚合物浓度，因此沿系线形成的所有LLPS系统共享相同的S蛋白分配系数。因此，我们预计体积比越极端，浓缩效果越好，导致E-AB检测灵敏度提高。这一假设通过在不同体积比（1:1, 9:1, 和 99:1，分别来自LLPS₁, LLPS₂, 和 LLPS₃）的LLPS中富集S蛋白，并进行E-AB检测 assay，同时设置仅缓冲液和无LLPS对照来验证。从LLPS₁提取的S蛋白与无富集对照相比没有产生显著的信号增益（p = 0.2335）。另一方面，从LLPS₂和LLPS₃提取的样品显示出明显的改善（分别为p = 0.0084和p < 0.0001）。这可以通过LLPS₁的浓缩倍数不足来解释，导致样品中的S蛋白仍然无法检测。通过LLPS₂和LLPS₃的10倍和100倍富集，S蛋白可以显著浓缩，并通过E-AB可靠地检测到，否则在没有通过分离LLPS进行样品预处理的情况下无法检测到该浓度。

最后，我们测试了LLPS从人体生物体液中富集S蛋白的兼容性。除了鼻咽和口咽拭子采样方法外，收集流涎唾液或尿液是首选，因为它们易于大量获取且引起患者不适最小，而人血清提供了一种微创采样方法，可解锁用于疾病诊断的系统性分子景观。为了验证LLPS在此类生物体液中的功效，将S蛋白加入到在100%人工唾液、100%合成尿液和1%人血清中制备的99:1 VR的LLPS中，与1×PBS进行比较。将富集的S蛋白提取物进行E-AB检测。基于唾液、尿液和血清的LLPS均证明了成功的蛋白质富集， evidenced 电化学信号的明显增益，而未富集的蛋白质仍然未被检测到。这表明了两相系统在这些生物体液中的潜在适用性。虽然基质效应（如唾液粘度或人样本中存在大量非目标蛋白）可能带来转化挑战，但一些研究已经证明使用电化学适体生物传感器在未稀释或最小程度处理的生物体液中进行兼容检测的可行性。这些发现支持了我们的LLPS E-AB在临床应用中可行性。这项研究通过克服与低目标分析物浓度相关的灵敏度挑战， potentially 推进了POC诊断的发展。

结论

本文报道了一种新型全水相分离方法的应用，通过分析物富集和分子拥挤效应提高电化学适体生物传感器的性能。我们提供了一种替代且有前景的提高检测灵敏度的解决方案。以SARS-CoV-2刺突蛋白和适体SNAP1.50为模型，我们证明了在指定体积比下通过LLPS进行可预测的富集，并将该方法与适体电化学生物传感器集成。与其他信号放大策略不同，LLPS独特且简单，专注于从唾液和其他生物体液中上游蛋白质富集。该系统通过优化两种聚合物的组成，可以灵活地富集其他蛋白质。这特别适用于依赖生物LLPS在宿主细胞中浓缩以进行病毒复制的病毒蛋白。类似地，可以实现其他适体用于替代靶标特异性检测。因此，该原型通过应用特定定制，在POC环境中对各种蛋白质和其他生物标志物分析物的诊断测量具有广泛潜力。

实验部分

材料和仪器

所有寡核苷酸均订购自Sangon（中国）。薄膜金微电极（ED-SE1-AuPt）购自MicruX Technologies（西班牙）。SARS-CoV-2刺突蛋白（S1N-C52H3）购自ACROBiosystem。重组SARS-CoV-2 S GCN4-IZ Alexa Fluor 488蛋白（AFG10796）购自Bio-Techne。辣根过氧化物酶偶联重组抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白抗体（抗 Spike HRP-Ab）购自Abcam。葡聚糖（M.w. = 10 kDa）购自Aladin。溶菌酶、人血清免疫球蛋白（IgG）、人血清白蛋白（HSA）、人血清（H4522）、人工唾液、合成尿液稀释剂、30%过氧化氢（H₂O₂）、氢醌（HQ）、6-巯基-1-己醇（MCH）、三(2-羧乙基)膦（TCEP）、聚乙二醇（PEG, BioUltra, M.w. = 8 kDa）和异硫氰酸荧光素-葡聚糖（M.w. = 4 kDa）购自Sigma。所有电化学测量均使用PalmsSens4恒电位仪和Drop-cell Connector（ED-DROP-CELL）进行，购自MicruX technologies。

通过显微成像 assay 验证LLPS刺突蛋白浓缩

空白水相液滴由PEG和FITC-葡聚糖制备。含刺突蛋白的液滴由PEG、葡聚糖和Alexa Fluor 488重组S蛋白制备。两种液滴配方均以9 wt.% PEG和4 wt.%葡聚糖的浓度制备，以形成全水相液滴。将液滴移液到干净的显微镜载玻片（ISOLAB GmbH）上，在室温条件（22 °C, 55–65% 湿度）下进行。载玻片通过用乙醇擦拭、在乙醇中超声处理15分钟、用异丙醇和Milli-Q水清洗、并用氮气流干燥，然后在65 °C加热1小时进行制备。使用Nikon Ti2-E Widefield显微镜捕获明场图像和荧光图像，激发波长为475 nm，用于FITC-葡聚糖和Alexa Fluor 488通道。使用ImageJ（NIH）软件进行图像处理。

比色酶联寡核苷酸测定（ELONA）

将生物素化的SNAP1.50 DNA适体在PBSMT（1× PBS with 2 mM MgCl₂ and 0.05% Tween-20）中稀释至1 μM。将100 μL稀释的适体溶液加入Pierce Streptavidin Coated High-Capacity Plate（ThermoFisher）每孔中，并在4 °C摇动孵育过夜。然后，用PBSMT洗涤板三次。加入5%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）溶液（GoldBio）在PBSMT中进行表面封闭，孵育至少2小时，随后用PBSMT洗涤。加入100 μL刺突蛋白标准品（10 nM）或从两相平衡混合物中提取的样品（在3000 × g离心5分钟后），并允许结合1小时。洗涤后，加入抗 Spike HRP-Ab（Abcam, 1:5000稀释于PBST）结合30分钟。用PBSMT洗涤后，加入50 μL 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate（ThermoFisher）并孵育15分钟。除非另有说明，上述所有步骤均在室温下处理。加入H₂SO₄（2 M）以终止反应。使用Varioskan Flash spectral scanning multimode reader（ThermoFisher）测量450 nm处的吸光度。

电化学适体传感器制造

首先用乙醇然后用Milli-Q水冲洗MicruX薄膜电极。将电极在水浴中超声处理5分钟，并通过在0.5 M NaOH中从?0.35到?1.35 V进行50次循环伏安（CV）进一步清洁。随后在0.5 M H₂SO₄中以0.1 V s^?1从?0.35到1.25 V进行10次CV扫描。

将硫醇修饰的SNAP1.50适体首先用TCEP（寡核苷酸与TCEP摩尔比为1:100）在室温下还原2小时以 cleavage 二硫键。将还原的适体溶液在1×PBS中稀释至0.5 μM。将五微升溶液滴在金上进行固定，在室温下过夜。用Milli-Q彻底冲洗后，用6 mM MCH封闭电极3小时。冲洗电极并进一步用1% BSA溶液封闭1小时。所有孵育步骤均涉及湿度控制以防止溶液干燥。冲洗电极并在使用前储存于4 °C。

LLPS浓缩和电化学测量

首先通过在缓冲液中溶解和混合PEG（平均M.w. = 8 kDa）和葡聚糖T10（平均M.w. = 10 kDa）来制备LLPS。加入刺突蛋白，将LLPS均质化并以3000 × g离心5分钟，从底部DEX富集相收集浓缩的刺突蛋白。将提取的DEX富集相滴在适体固定的金电极上，在室温下结合1小时。用PBS彻底冲洗后，加入10 nM抗 Spike HRP-Ab溶液孵育45分钟。最后，加入底物溶液（5 mM H₂O₂和5 mM HQ in 1×PBS）孵育5分钟。立即通过方波伏安法（SWV）从?0.5到0.1 V interrogate 电极。测量振幅和频率分别为5 mV和25 Hz。记录约?0.2 V处的峰值电流值作为信号输出。方波伏安图从PSTrace 5.9提取。

统计分析

误差棒代表一个标准偏差的不确定性。除非指定，否则为每个浓度制备三个独立的传感器（n = 3）。进行双样本t检验以确定任何两个实验组之间的统计显著性。ns表示不显著，p > 0.05。* 表示 p ≤ 0.05。*表示 p ≤ 0.001。所有数据均通过Origin分析和绘图。

致谢

R.H.P.S.和Y.Z.对这项工作的贡献相同。该项目获得了国家自然科学基金（22302128）、广东省基础与应用基础研究基金（No. 2024A1515010990）、深圳市科技计划（RCBS20231211090713027）、深圳市发展和改革委员会战略性新兴产业发展支持计划（XMHT20240115002）以及香港特别行政区政府创新及科技基金（ITF）的资助，资助号SST/118/20GP。H.C.S.和W.G. acknowledges 香港研究资助局（RGC）提供的普通研究基金（Nos. 17306221 and 17317322）和合作研究基金（C7165-20GF）的财务支持。这项研究 also 由香港大学研究委员会向J.A.T.提供的转化种子基金资助。H.C.S. also 部分由RGC的RGC高级研究基金（SRFS2425-7S04）资助，H.C.S.和J.A.T.均获得香港特别行政区政府创新科技署Health@InnoHK计划的资助。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。