肠道菌群通过血浆代谢物影响缺铁性贫血风险的孟德尔随机化研究

本刊推荐：本研究采用三样本孟德尔随机化（MR）分析，揭示肠道菌群通过血浆代谢物介导影响缺铁性贫血（IDA）风险的因果路径。发现Jiangellaceae科细菌通过提升1-棕榈酰-2-硬脂酰-甘油-3-磷酸胆碱（PSPC）水平降低IDA风险（间接效应占比18.55%），为微生物-造血轴机制研究提供新方向。

　　

ABSTRACT

Objectives

Previous research indicates that gut microbial composition significantly affects iron metabolism and absorption, potentially influencing the risk of iron deficiency anemia (IDA). This study aimed to investigate how plasma metabolites might mediate the relationship between gut microbiota and IDA.

Methods

We performed MR analyses utilizing publicly available genome-wide association study (GWAS) data, comprising 5,959 individuals for gut microbiota characterization and 8,299 individuals for plasma metabolite profiling. Outcome data for IDA were sourced from large-scale cohorts including Pan-UKB, FinnGen, and GERA, collectively encompassing 28,075 IDA cases and 857,930 controls. We assessed the mediating role of identified plasma metabolites on the relationship between gut microbial taxa and IDA using the product-of-coefficients method.

Results

Our analyses identified 18 gut bacterial taxa and numerous plasma metabolites with potential causal links to IDA. For example, genetically higher abundance of species Ruminococcus E sp003521625 increased IDA risk (OR = 1.20; 95% CI = 1.04–1.39; P = 0.011), whereas higher abundance of family Jiangellaceae decreased risk (OR = 0.77; 95% CI = 0.61–0.98; P = 0.035). Mediation analyses revealed that the metabolite 1–palmitoyl–2–stearoyl–glycero–3–phosphocholine (PSPC) significantly mediated the Jiangellaceae – IDA association, with an indirect effect of ?0.0477 (95% CI = ?0.0952 to ?0.0001; P = 0.049) accounting for approximately 18.55% of the total effect.

Conclusion

Our findings validate the crucial role of gut microbiota in IDA etiology, highlighting mediation via key plasma metabolites. These insights enhance understanding of the gut microbiota-hematopoiesis axis and offer potential avenues for novel biomarkers or therapeutic interventions targeting IDA.

Introduction

缺铁性贫血（IDA）是一个全球性的重大健康问题，显著影响儿童、妇女和老年人的健康。全球约有12亿人受到IDA的影响，在低收入和中等收入国家患病率最高，这些地区普遍存在膳食铁摄入不足、高感染率以及怀孕等特殊时期铁需求增加的情况。临床上，IDA表现为一系列非特异性症状，常见症状包括严重疲劳、运动能力下降、呼吸困难、心悸和认知障碍。在严重病例中，IDA可导致缺铁母亲所生儿童的神经认知缺陷，并增加不良妊娠结局的风险。IDA的影响超越个体健康，影响社会生产力和经济稳定，导致工作表现下降、认知障碍和生活质量差。

IDA的发病机制涉及多种机制。主要原因是膳食铁摄入不足、慢性失血（如胃肠道出血、月经过多）导致的铁损失增加，或铁需求增加（如怀孕期间）。此外，炎症通过增加铁调素（hepcidin）水平在IDA的发展中起着至关重要的作用，铁调素抑制铁的吸收和回收。

肠道菌群与IDA之间的相互作用已成为一个新兴的研究领域。铁是至关重要的微量营养素，其缺乏影响着全球数百万人。新出现的证据表明，肠道菌群显著影响铁代谢和吸收，因此在IDA的发生和进展中发挥作用。菌群失调，即肠道菌群失衡，可通过增加肠道通透性和炎症来加剧IDA，从而阻碍铁吸收。观察性研究表明，IDA与肠道菌群组成的显著改变有关，包括有益细菌（如Faecalibacterium）的减少和致病细菌的增加。

虽然众所周知肠道菌群通过其代谢物影响宿主，但影响IDA的具体代谢物仍不清楚。短链脂肪酸（SCFAs）——主要是乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐——由膳食纤维的细菌发酵产生，在能量稳态、免疫调节和肠道屏障维护中发挥重要作用。此外，SCFAs可通过改变管腔pH值、调节炎症反应以及影响肠上皮中铁转运蛋白的表达来影响铁代谢。在IDA中，某些SCFAs和其他微生物代谢物的水平据报道会发生变化，表明在疾病发展和进展中起促进作用。

重要的是，饮食模式和营养摄入——包括铁、维生素C、纤维和其他成分——可显著塑造肠道菌群组成并影响铁吸收。这些饮食因素在评估微生物群-IDA关系的观察性研究中是关键混杂因素。通过在孟德尔随机化（MR）框架内使用遗传工具，我们的研究减少了饮食和其他生活方式因素的混杂；然而，在解释肠道菌群与IDA之间的关联时，承认饮食的影响是至关重要的。

MR使用遗传变异作为工具变量来评估可改变暴露与特定结果之间的因果关系，从而有效减轻混杂变量的偏差并避免反向因果关系的问题，前提是某些关键假设成立。虽然先前的观察性和遗传学研究已提示肠道菌群与铁状态之间存在关联，但据我们所知，尚无研究应用多步骤MR框架来评估血浆代谢物是否介导这些关系。我们的分析在一个三样本设计中整合了大规模微生物组、代谢物和IDA数据集以得出因果估计并测试中介作用，从而为微生物群-代谢物-铁轴提供新的见解。通过识别特定影响铁代谢的微生物分类群和代谢物，我们的研究旨在超越描述性“理解”，朝着开发诊断生物标志物和靶向治疗策略的方向发展，这些策略可以补充传统的铁状态测量方法，如转铁蛋白饱和度。

Materials and methods

Study design

我们的分析利用了公开可用的全基因组关联研究（GWAS）摘要级数据。研究设计示意图见图1。最初，进行了正向和反向MR以及连锁不平衡评分回归（LDSC）分析，以研究肠道菌群与IDA之间的关联。本研究中使用的摘要级数据集来自先前发表的GWAS。FINRISK微生物组GWAS数据包括473个独特的分类群，是在2007年至2014年间的调查周期中收集的；来自CLSA的血浆代谢物分析包含1,091种代谢物和309种代谢物比率，对象为2011年至2015年间招募的参与者；来自Pan-UKB、FinnGen和GERA的IDA摘要统计数据对应于2009年至2023年间的发布，具体的诊断和人口统计详细信息总结在表1中。我们在2025年1月访问了所有摘要级数据，并在2025年2月完成了分析。每个组成部分的研究在数据收集时都获得了伦理批准，所有参与者都提供了知情同意。我们的分析程序遵循了STROBE-MR指南。我们的MR分析的功效使用在线工具进行了评估。鉴于数据来源于五个独立的数据库，样本重叠的可能性被大大降低。所有纳入的GWAS数据集完全由欧洲血统的个体组成；因此，这些发现可能不适用于非欧洲人群。此外，由于只有摘要级数据可用，我们无法按年龄或性别进行分层分析，这限制了对人口统计学特异性效应的探索。

为了进行MR分析，工具变量（IV）必须满足三个基本标准：（1）所选遗传变异应与所研究的暴露有稳健关联；（2）这些变异必须独立于可能影响结果的其他因素以避免混杂；（3）遗传变异与结果之间的关系应仅通过所讨论的暴露发生。当使用P < 5 × 10^?8的阈值并应用严格的连锁不平衡（LD）聚类设置（IVs之间距离10,000 kb且r² < 0.001）时，我们发现只有284个细菌分类群和839种血浆代谢物分别共有324和2,230个单核苷酸多态性（SNPs）符合这些标准。为了满足第一个MR分析假设，GWAS识别的暴露 subjected to a threshold of P < 5 × 10^?6。对于每个SNP，使用公式F = beta2/se2计算F统计量，确保弱IVs的影响减小。F统计量低于10的SNPs被排除在分析之外。为确保一致性，效应等位基因在暴露和结果数据集之间对齐，排除任何不匹配的等位基因。此外，次要等位基因频率（MAF）接近0.5的模糊回文SNPs也被丢弃以避免错误。缺失的SNP关联（即暴露数据集中存在但结果数据集中缺失的SNPs）未被用于替代缺失的IVs，因为一小部分工具缺失且对结果影响最小。为了检测多效性，我们实施了MR多效性残差和与离群值（MR-PRESSO）检验和MR-Egger截距检验。我们排除了显示显著水平多效性的MR估计值进行荟萃分析。最后，为了维持第三个MR假设，显著与结果相关的SNPs（P < 5 × 10^?6）被排除。在初步IV选择之后，正向MR分析包括1,178种血浆代谢物和416个细菌分类群。

Ethics approval and consent to participate

这项研究基于对公开可用数据库的二次分析；不需要机构审查委员会的额外批准。分析中包括的所有研究都得到了各自机构审查委员会和伦理委员会的批准，并获得了所有参与者的书面知情同意。FINRISK研究方案的伦理批准由赫尔辛基和Uusimaa医院区的协调伦理委员会获得。涉及来自CLSA的血浆代谢物的GWAS得到了犹太总医院研究伦理委员会的批准。Pan-UKB项目在伦理上受英国生物银行伦理咨询委员会的监督，该委员会在英国生物银行委员会的授权下运作。FinnGen研究的伦理监督同样由赫尔辛基和Uusimaa医院区的协调伦理委员会提供。此外，GERA研究得到了加州大学旧金山分校机构审查委员会的伦理批准。

Statistical analysis

在随机效应框架下，主要MR估计使用逆方差加权（IVW）方法计算。当所有遗传变异都满足基本MR假设时，可以获得最精确的估计，因为IVW方法在无水平多效性的情况下最有效。此外，进行了三种敏感性分析：加权中位数、MR-Egger和MR-PRESSO。当怀疑存在定向多效性时，MR-Egger非常有价值，因为它可以通过截距项测试多效性并提供更保守的估计。显著的截距值表明存在定向多效性。加权中位数方法比IVW方法更不易无效，并提供更可靠的估计，特别适用于存在轻微多效性的情况。如果存在或多疑存在多效性，MR-PRESSO通过排除违反排除限制假设的离群变异的影响来提高因果估计的准确性。采用Cochran’s Q检验评估SNPs之间的异质性。为了进一步研究水平多效性，进行了MR-Egger截距检验。在截距或全局检验中P值小于0.05的SNPs（表明显著多效性）以及涉及少于四个SNPs的情况被从荟萃分析中省略，因为MR-PRESSO需要至少四个SNPs。最后，使用固定效应荟萃分析综合了来自IVW方法和敏感性分析的估计。然而，显示显著异质性或与敏感性分析不一致的IVW结果被排除。我们使用LDSC研究IDA与先前识别的肠道菌群之间的遗传相关性。使用HapMap3作为参考，从GWAS数据中排除了非SNP和MAF低于0.01的SNPs、重复以及链方向模糊的SNPs。LDSC通过分析LD与检验统计量之间的链接有效识别遗传相关性。遗传相关性是通过将一个性状的变异z值与另一个性状的z值相乘，然后将这些乘积对LD得分进行回归来确定的。

进行了两步MR以执行中介分析。为了简化过程，我们首先检查了细菌、代谢物和IDA之间的关系，随后研究了已识别的胃肠道微生物群与血浆代谢物之间的关联。应用系数乘积法估计由代谢物介导的微生物群对IDA的影响。将中介效应（ME）除以总效应以确定中介比例。

为了控制错误发现率，在MR研究的荟萃分析中应用了Bonferroni校正。对于肠道菌群和血浆代谢物，当IVW p值分别小于1.20 × 10^?4 (0.05/416) 和 4.24 × 10^?5 (0.05/1178) 时，认为因果关联显著，并且当IVW p值介于上述阈值和0.05之间时被认为是提示性的。使用R软件（版本4.3.1）中的TwoSampleMR和meta包进行所有分析。

Results

Gut microbiota and IDA

对416个细菌分类群进行了荟萃分析。最终，我们确定了18个与IDA存在提示性关联的肠道微生物分类群。汇总的逆-IVW分析表明，遗传推断的物种Ruminococcus E sp003521625（OR = 1.204; 95% CI: 1.044–1.388; P = 0.0111）和另外八个微生物分类群的较高丰度与发生IDA的风险升高相关。相反，遗传推断的Jiangellaceae科（OR = 0.773; 95% CI: 0.609–0.982; P = 0.035）和另外八个微生物分类群的较高丰度似乎具有保护作用，可能降低IDA风险（图2）。包括主要发现和相关敏感性分析在内的全面结果如图3所示。

我们通过MR分析进一步探讨了潜在的反向因果关系，检查了遗传预测的IDA对先前确定的18个肠道微生物群分类群丰度的影响。该分析显示，遗传预测的IDA与物种Ruminococcus E sp003521625的丰度呈负相关（Beta = ?0.028; 95% CI: ?0.054 to ?0.003; P = 0.030）（图4）。

此外，对十个具有足够遗传力和样本量的微生物分类群进行了LDSC分析。然而，这些分析未发现IDA与所选肠道微生物群之间存在显著的遗传相关性。

Plasma metabolites and IDA

正向MR分析的结果揭示了65种遗传推断与IDA存在潜在因果关联的血浆代谢物。随后，我们进行了涉及1,170次独立测试（65 × 18）的全面MR评估，以探索肠道微生物群与这些代谢物之间的潜在因果联系。该筛选确定了20个特定的微生物群-代谢物配对适用于后续的中介评估（图5）。值得注意的是，遗传易感性导致的Jiangellaceae科丰度增加与1-棕榈酰-2-硬脂酰-甘油-3-磷酸胆碱（PSPC）水平升高存在显著的因果关联（Beta = 0.684; 95% CI: 0.261–1.107; P = 0.002）。

Mediation analysis

我们进一步评估了这20个微生物群-代谢物组合中的潜在中介效应。我们的中介分析发现，Jiangellaceae科丰度与IDA风险之间的关系由PSPC水平显著介导，产生的ME为?0.0477（95% CI: ?0.0952 to ?0.0001; P = 0.049）。这种间接效应约占观察到的总关联的18.55%。

Sensitivity analysis, pleiotropy, and heterogeneity

在数据分析阶段，为保证我们结论的可靠性和稳健性，我们系统地排除了与敏感性分析（包括加权中位数、MR-Egger和MR-PRESSO方法）结果冲突的任何IVW估计值。此外，表明显著多效性的IVW估计值——由具有统计学意义的截距项（P < 0.05）或显著的MR-PRESSO全局检验结果（P < 0.05）定义——也被移除以保持分析有效性。此外，通过Cochran's Q统计量严格评估了异质性，结果表明大多数个体SNP关联以及荟萃分析摘要显示最小或无异质性，强调了我们的分析方法的稳定性并增强了我们研究结果的置信度。

Discussion

本研究旨在调查肠道菌群与IDA之间的因果关系，并进一步使用三样本MR方法探讨血浆代谢物在这种关联中的中介作用。通过整合来自欧洲人群的大规模GWAS摘要统计数据，我们确定了18个与IDA存在显著因果关联的肠道微生物分类群。其中，物种Ruminococcus E sp003521625与IDA风险增加相关，而Jiangellaceae科与风险降低相关。中介分析显示，PSPC显著介导了Jiangellaceae科对IDA的影响，占总效应的18.55%。这些发现为潜在的微生物群-代谢物-IDA通路提供了新的见解，并突出了预防或干预的可能靶点。

我们的研究发现Jiangellaceae科与IDA风险呈负相关，其保护作用部分由PSPC介导，占总效应的18.55%。虽然Jiangellaceae科在先前文献中未直接与IDA关联，但其所属的放线菌纲（Actinobacteria）与宿主脂质代谢相关，这可能影响铁的吸收和利用。尚无先前研究报道PSPC作为微生物群-IDA通路的中介物，这使得这是我们工作的一个重要新颖贡献。

Jiangellaceae科的成员产生具有抗炎和抗菌特性的生物活性化合物。例如，Jiangella gansuensis产生的化合物抑制巨噬细胞中一氧化氮的产生，表明其在调节免疫反应中发挥作用。通过减少炎症，Jiangellaceae科可能有助于降低铁调素水平，这是一种在炎症期间增加并减少铁吸收和动员的激素，从而有助于维持铁稳态。Jiangellaceae科可能直接增加PSPC水平的具体机制在现有文献中没有详细说明。然而，细菌，包括来自Jiangellaceae科的细菌，可以通过产生修饰脂质分子的特定酶来影响脂质代谢。这与我们的发现一致，即Jiangellaceae科与通过提升PSPC水平降低IDA风险相关。1-棕榈酰-2-硬脂酰-gpc是一种磷脂分子，通常存在于细胞膜中，作为结构成分发挥重要作用。细胞膜中磷脂的组成可以影响膜流动性和功能。这影响了参与铁转运和储存的膜结合蛋白的活性，从而影响铁代谢。研究表明，红细胞膜的脂肪酸组成可以影响其功能和寿命。特定磷脂（如PSPC）的增加可以增强红细胞的稳定性和功能，这对于维持足够水平的功能性红细胞和预防贫血至关重要。这种关系突出了脂质分子在调节铁吸收、转运和储存以及维持红细胞功能和减少炎症中的重要性。

尽管有这些假设，肠道菌群影响缺铁性贫血的精确机制通路仍然不完全清楚。潜在机制包括通过炎症信号调节铁调素和其他铁调节激素、影响铁吸收的肠道屏障完整性的改变、结合铁或调节其转运的微生物代谢物或铁载体的分泌，以及影响红细胞膜组成的宿主脂质代谢的变化。然而，缺乏将特定微生物分类群或代谢物与这些过程联系起来的决定性实验证据。未来的研究需要整合多组学方法并在细胞或动物模型中进行功能验证，以阐明连接肠道菌群与铁稳态的复杂生物学通路。

这项研究提供了几个显著优势。主要地，它采用了MR，一种通过最小化混杂和反向因果关系问题来有效推断因果关系的严谨统计方法。此外，分析利用了具有大量样本量的公开可用的GWAS数据集，纳入了超过28,000名IDA患者和超过857,000名对照，从而显著增强了统计稳健性。此外，我们对肠道菌群在IDA中因果作用的探索整合了正向和反向MR分析，并辅以对血浆代谢物作为中介物的检查。这种多维方法使得能够更深入地理解微生物-造血轴。最后，荟萃分析、各种敏感性检验（包括MR-Egger、加权中位数和MR-PRESSO方法）以及通过LDSC进行的遗传相关性分析的整合，通过全面评估和减轻多效性和异质性，进一步巩固了我们研究结果的可信度。

然而，这项研究有几个值得考虑的局限性。尽管MR有效减少了来自混杂和反向因果关系的偏差，但潜在的残余偏差——例如由于人群间等位基因频率变化导致的人群分层——可能持续存在。为了抵消这种偏差，我们将分析限制在欧洲血统的人群；这种排他性意味着我们的发现可能无法推广到非欧洲人群。此外，所有纳入的GWAS数据集仅提供摘要统计数据，阻止了我们按年龄或性别进行全面亚组分析。缺乏人口统计学分层限制了我们探索遗传关联是否因年龄或性别而异的能力，并可能降低我们结果对特定亚群的适用性。此外，由于研究的暴露数量庞大，手动消除潜在多效性SNPs是不切实际的。因此，我们采用了多个独立的IDA数据库并通过荟萃分析结合发现，增强了我们结果的可靠性和一致性。显示多效性证据的分析被从最终结果中排除。尽管在各种数据集之间注意到微小的差异，但总体异质性仍然很低，证实了我们结论的稳定性。未来的研究应旨在进行更多样化和广泛的数据收集，从而实现详细的分层分析，以更好地捕捉人口统计学变异并增强代表性。

我们的研究强调了肠道菌群和血浆代谢物在IDA发病机制中的重要作用。我们确定了与IDA有因果关联的特定肠道菌群物种和血浆代谢物，例如Jiangellaceae科及其通过PSPC的影响。这些发现不仅有助于学术上理解肠道菌群、血浆代谢物和IDA之间复杂的相互作用，而且对开发靶向治疗策略具有实际意义。未来的研究应侧重于阐明这些相互作用的详细机制，并探索旨在调节肠道菌群以预防或减轻IDA的潜在干预措施。