血小板参数与乳腺癌风险的因果解码：孟德尔随机化研究揭示雌激素受体特异性关联

本综述采用孟德尔随机化（MR）方法，深入探讨血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）和血小板压积（PCT）与乳腺癌（含ER+/-亚型）的因果关联。研究发现PCT和MPV增加整体及ER+乳腺癌风险，而PDW展现保护作用，为乳腺癌风险预测和靶向干预提供了新的生物标志物和理论依据。

　　

引言

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展与遗传、内分泌、生活方式及环境因素密切相关。雌激素受体（ER）状态对乳腺癌的治疗和预后具有重要意义，根据ER表达水平可分为ER阳性（ER+）和ER阴性（ER-）亚型，两者在生物学行为、治疗反应及预后方面存在显著差异。尽管乳腺癌的诊断和治疗取得了显著进展，但风险评估仍是预防和治疗策略的关键。

血小板作为血液循环中的重要组成部分，其功能已超越传统的凝血作用，被证明与乳腺癌等肿瘤的发展进程相关。研究表明，血小板分泌的血管内皮生长因子（VEGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）可通过刺激内皮细胞增殖和迁移促进血管生成，这是肿瘤生长的关键过程。例如，Jiang等人发现血小板释放的VEGF通过VEGF受体2-整合素协同信号刺激乳腺癌细胞增殖。血小板衍生的PDGFB通过促进肿瘤微环境（TME）中癌症相关成纤维细胞的募集参与肿瘤进展。此外，血小板还可通过表面过表达的免疫检查点分子抑制T细胞活性并增强髓系细胞（中性粒细胞、经典单核细胞）的促肿瘤功能，从而在乳腺癌中形成免疫抑制性TME。

血小板参数是评估血小板功能和数量的重要指标，包括血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）和血小板压积（PCT）。近年来，越来越多的研究表明，血小板参数的变化与结直肠癌、肝癌、子宫内膜癌和肺癌等肿瘤的发生、转移和预后相关。对于乳腺癌，一项回顾性队列研究发现PCT可预测临床结局和预后。高水平的MPV、PDW和PLT与乳腺癌不良预后相关。例如，MPV升高（表明血小板活化）与乳腺癌的远处转移、原发肿瘤大小和肿瘤-淋巴结转移分期相关。其机制可能是活化的血小板聚集并包裹肿瘤细胞形成微血栓，帮助肿瘤细胞逃避免疫攻击（如NK细胞、巨噬细胞等），从而促进转移和进展。尽管这些研究可能发现血小板参数与乳腺癌之间的关联，但血小板参数与乳腺癌及其ER+和ER-亚型风险之间的因果关系尚未得到深入研究。

孟德尔随机化（MR）分析是流行病学研究中广泛用于推断暴露与结果之间因果关系的方法。使用遗传变异作为工具变量（IVs）可以有效克服传统观察性研究中的混杂因素和反向因果关系问题。先前的MR分析已证明血小板参数（如PLT）与肝癌和肺癌之间存在因果关系，但尚未见与乳腺癌相关的报道。本研究旨在通过MR分析推断与四种血小板参数密切相关的遗传变异与乳腺癌及其ER+和ER-亚型之间的因果关系，有望为乳腺癌的预防和治疗带来新的突破和机遇。

材料与方法

数据来源

四种血小板参数（PLT、MPV、PDW和PCT）相关的遗传工具选自一项基因组关联研究（GWAS），该研究包含英国生物银行中的408,112名欧洲参与者。乳腺癌协会 consortium（BCAC）提供了总体乳腺癌（122,977例）、ER+亚型（69,501例）、ER-亚型（21,468例）和对照（无乳腺癌，105,974例）的汇总数据。所有病例和对照均为女性。

工具变量选择

选择与四种血小板参数显著相关（P < 5.0×10^?8）的单核苷酸多态性（SNPs）作为工具变量。为消除连锁不平衡（LD）的影响并获得独立可靠的SNPs，设置了特定参数：r² < 0.001和聚类距离=10,000 kb。从结果变量的GWAS数据集中提取与暴露相关的SNPs，记录为工具变量，包含效应等位基因、等位基因效应大小（β）、标准误和P值等信息。进行SNP协调以确保暴露和结果数据集之间效应等位基因方向的一致性。最终，排除结果数据中缺失或经过上述步骤后仍无法匹配的SNPs。通过F统计量评估每个工具变量的强度，F > 10表示无弱工具变量偏倚。

研究设计

为确保MR分析中因果效应的准确评估，作为工具变量的SNPs需遵循三个基本假设：首先，工具变量应与血小板参数（作为暴露变量）显著相关；其次，工具变量必须独立于所有潜在混杂因素；最后，工具变量只能通过血小板参数影响乳腺癌（作为结果变量）。

统计分析

采用逆方差加权（IVW）、加权中位数、MR-Egger回归、简单模式和加权模式方法推断MR分析中的因果关系。其中，IVW是主要方法。当每个遗传变异均适用于工具变量假设时，它整合了来自不同SNPs的因果效应的Wald比率估计，并提供了暴露对结果因果效应的一致估计。当工具变量不存在水平多效性时，IVW方法的结果最可靠。加权中位数可在至少一半的SNPs作为有效工具变量时提供因果效应的一致估计。MR-Egger回归用于评估工具变量的水平多效性，其截距表示水平多效性的估计效应。当工具变量存在水平多效性时，MR-Egger回归仍可提供因果关联的无偏估计。与MR-Egger方法相比，加权中位数方法的结果具有更高的准确性。简单模式和加权模式作为补充分析。

使用TwoSampleMR包进行工具变量的异质性检验和水平多效性评估。具体而言，利用“mr_heterogeneity”函数计算Cochran’s Q值及其对应P值，用于评估不同SNPs之间效应估计的一致性。采用“mr_egger_regression”函数进行MR-Egger回归分析，获取截距估计值及其P值以评估水平多效性。P值>0.05表示无异质性或水平多效性。此外，使用MR多效性残差和与异常值（MR-PRESSO）检验通过去除异常值来检测和校正水平多效性。通过MR-PRESSO包中的“mr_presso()”函数执行，参数设置为：OUTLIERtest = TRUE, DISTORTIONtest = TRUE, NbDistribution = 1000, 和SignifThreshold = 0.05。此外，采用MR-稳健调整轮廓评分（RAPS）方法校正由异质性和系统性多效性引起的偏倚（P < 0.05），即使在存在多个弱工具变量的情况下，也能提供可靠的因果关联估计。还采用MR Steiger过滤消除结果变异性高于暴露的SNPs，并评估保留的SNPs与暴露/结果的因果方向性，这对于避免反向因果关系偏倚或多效性风险至关重要。方向为“TRUE”且P < 0.05具有统计学意义。

此外，使用来自英国生物银行的独立数据集重复分析以验证结果的稳健性，并基于东亚人群数据集评估其普适性。采用Bonferroni校正识别多重检验产生的假阳性结果。P < 0.004 [0.05/(4暴露×3结果)]被认为具有统计学意义，0.004 < P < 0.05被认为存在潜在关联的提示性证据。所有统计分析均使用R软件（版本4.4.0）进行。

结果

工具变量选择

从GWAS中提取与血小板参数显著相关（P < 5×10^?8）的工具变量，并排除具有强LD（r² < 0.001，10,000 kb）的SNPs。随后，去除回文SNPs（即A/T或G/C）和结果中不可用的SNPs。最终，选择411个PLT的SNPs、319个PDW的SNPs、405个PCT的SNPs和377个MPV的SNPs用于乳腺癌的MR分析。总计，选择411个PLT的SNPs、322个PDW的SNPs、407个PCT的SNPs和379个MPV的SNPs用于ER+乳腺癌的MR分析。总计，选择412个PLT的SNPs、322个PDW的SNPs、409个PCT的SNPs和376个MPV的SNPs用于ER-乳腺癌的MR分析。所有工具变量的F统计量均>10，表明无弱工具变量偏倚。

血小板参数对乳腺癌风险的因果效应

经过Bonferroni校正后，MR分析支持PCT与总体乳腺癌风险增加（OR, 1.0693 [95% CI, 1.0281–1.1121]; P = 0.0008）和ER+乳腺癌风险增加（OR, 1.0691 [95% CI, 1.0233–1.1169]; P = 0.0028）之间的因果关系。PLT与总体乳腺癌风险增加之间存在提示性的因果关系（OR, 1.0351 [95% CI, 1.0003–1.0711]; P = 0.0483）。PDW可能与总体乳腺癌及其两种亚型的风险降低存在提示性关联（0.004 < P < 0.05）。尽管PDW对ER-乳腺癌的MR-Egger结果与其他MR方法相反，但无统计学意义，且IVW方法揭示的因果关系的准确性优于MR-Egger。此外，MPV与乳腺癌无关。

敏感性分析

尽管Cochran’s Q检验结果显示存在异质性，但随机效应IVW分析的主要结果允许存在一定异质性。MR-Egger截距（除PDW对ER-乳腺癌外）表明无多效性，P > 0.05。此外，留一分析未发现异常工具变量，进一步证实了结果的稳健性。经过全局MR-PRESSO检验后，需排除一些异常值以确保剩余SNPs的有效性。MR-PRESSO检验结果显示，在校正后的数据中，PCT与总体乳腺癌及其ER+亚型风险增加存在提示性因果关系。在校正和未校正的数据中，PDW均显示与总体乳腺癌及其亚型（ER+和ER-）风险降低存在提示性关联。值得注意的是，消除异常值后，PLT与总体乳腺癌之间的提示性关联消失（P = 0.2597），而MPV显示与总体乳腺癌存在提示性关联（P = 0.0291）。去除异常值后的MR分析进一步证实了上述结果。具体而言，PCT与总体和ER+乳腺癌风险增加存在提示性关联。MPV也与总体乳腺癌风险增加存在提示性关联。相反，PDW显示与总体、ER+和ER-亚型风险降低存在提示性关联。此外，MR-RAPS检验进一步证实了MR因果关联的有效性（所有P < 0.05）。Steiger检验显示所有MR结果的方向均为“TRUE”（P < 0.05），表明未受反向因果效应的影响。

基于独立数据集和东亚人群的外部验证

在独立数据集中的重复验证显示，除PDW对总体和ER+乳腺癌外，结果与主要分析一致。这些结果进一步支持了PCT对总体和ER+乳腺癌风险增加、MPV对总体乳腺癌风险增加以及PDW对ER-乳腺癌风险降低的提示性关联。然而，对东亚人群的跨种族验证未发现血小板参数与乳腺癌风险之间存在显著因果关联，表明此效应可能具有人群特异性。

讨论

本研究探讨了四种血小板参数与乳腺癌及其亚型（ER+、ER-）风险之间的因果关系。研究发现存在提示性的因果关系：PCT与总体乳腺癌和ER+风险增加、MPV与总体乳腺癌风险增加、以及PDW与总体乳腺癌及其两种亚型风险降低相关。然而，PLT与乳腺癌及其两种亚型风险之间无因果关系，MPV与ER+、ER-乳腺癌风险之间无因果关系，PCT与ER-乳腺癌风险之间也无因果关系。上述发现在独立数据集中得到重复验证，但未能推广到东亚人群。这些结果为理解血小板参数在乳腺癌发展中的作用提供了重要线索。

血小板在乳腺癌病理机制中的作用与其调节肿瘤血管生成和血管完整性以及影响TME相关。研究发现血小板释放的VEGF和PDGF可能通过促进血管生成和肿瘤生长影响乳腺癌的发展。血小板耗竭破坏了乳腺癌小鼠模型中的血管完整性，导致瘤内出血和随后的细胞死亡。血小板与髓源性抑制细胞（MDSCs）相互作用，抑制T细胞和自然杀伤（NK）细胞的抗肿瘤 immunity，形成免疫抑制微环境，促进乳腺癌肺转移。ER+乳腺癌中的TME通常是免疫抑制性的。抗血管生成治疗可逆转乳腺癌微环境的免疫抑制状态。众所周知，PCT代表血液中血小板的体积百分比。研究表明，它与无病生存相关，并可作为预测早期乳腺癌患者临床结果和预后的潜在生物标志物。这些可能表明PCT水平通过影响血管生成、血管完整性和TME的机制影响乳腺癌及其ER+亚型的风险。我们的MR结果中发现的PCT与总体和ER+乳腺癌风险增加的提示性因果关系与这些机制研究相呼应，进一步表明血小板在乳腺癌发展和进展中的潜在驱动作用。

MPV是外周血中血小板的平均体积，是血小板活化状态的指标。癌细胞与血小板之间的相互作用可触发血小板活化，从而增强血小板的促癌和促转移功能。据报道，抗血小板药物替格瑞洛通过抑制P2Y12介导的血小板活化抑制乳腺癌转移。此外，在乳腺癌患者中检测到显著更高的MPV水平，这与术前患者的淋巴结转移和Ki67增殖指数呈正相关。这些与本研究中MPV增加总体乳腺癌风险的MR提示性因果关系方向一致。

PDW是反映血小板体积大小变异性的参数，是血小板活化的另一个标志。血小板释放的促血管生成和抗血管生成因子之间平衡的改变可能影响肿瘤血管生成，从而抑制乳腺癌生长和转移。这意味着较高的PDW可能表明血小板处于更活跃的状态，而在此活跃状态下血小板释放的各种类型因子比例的不平衡可能影响乳腺癌进展。值得注意的是，文献中关于PDW与乳腺癌风险之间的关联仍存在争议。Liu等人证明较高的PDW水平与乳腺癌患者更好的化疗结果相关。此外，Takeuchi等人证实PDW也与ER状态相关。这与我们MR分析中PDW与总体乳腺癌及其两种亚型风险降低的提示性因果关系方向一致。然而，Huang等人报告了相反的结果，表明PDW升高可能作为乳腺癌不良预后的标志。这些差异可能源于观察性研究中难以避免的混杂因素。MR分析在一定程度上克服了这些限制，为它们之间的关系提供了更多的因果推断证据。

令人惊讶的是，本研究未发现PLT与乳腺癌及其两种亚型风险之间存在因果关系。然而，研究表明高PLT与乳腺癌患者的肿瘤进展、转移和较差的生存相关。应注意的是，本研究可能受样本量、混杂因素等限制，可能影响了结果的解释。未来的研究将避免上述缺陷，进一步探讨它们之间的关系。总体而言，我们的研究揭示了血小板参数与乳腺癌之间因果关系的提示性证据，为临床实践提供了潜在指导：首先，这些血小板参数作为血液检测中的常规项目，方便且成本低，有望作为新型生物标志物纳入乳腺癌风险预测模型，尤其对ER亚型患者的风险分层具有潜在价值。其次，针对血小板生成或功能调节的干预措施（如阿司匹林等抗血小板药物）在乳腺癌预防策略中需进行亚型特异性评估。第三，PDW的保护性关联表明血小板异质性可能通过血管生成因子比例失衡影响肿瘤微环境。

然而，一些局限性不容忽视。首先，本研究依赖于公开可用的GWAS汇总数据，尽管所选数据集已应用于其他MR研究，但仍可能存在潜在的质量偏倚。未来的研究可通过纳入个体水平数据进一步验证结果。其次，对东亚人群的验证未复制MR结果，这可能是种族特异性或统计效能不足引起的偏倚。后续研究应增加样本量并在多样人群中进行验证，以增强发现的普适性。第三，本研究未探讨长期慢性炎症状态、饮食和其他环境因素的综合效应，但这些在现实生活中与血小板功能和乳腺癌密切相关。鉴于本研究的提示性结果和局限性，后续研究将重点通过前瞻性临床队列研究和大规模、跨种族比较确认这些发现的可靠性和普适性。将整合多源数据，如临床数据和生物标志物数据，更全面地评估遗传变异对乳腺癌的影响。将进行临床干预研究，观察通过药物或生活方式改变改变血小板参数对乳腺癌风险和预后的影响，从而制定新的预防和治疗策略。将进行动物实验，深入探索PCT、MPV和PDW影响乳腺癌发展的分子机制。

结论

我们的MR分析揭示了四种血小板参数与乳腺癌及其亚型之间因果关系的提示性证据。遗传预测表明高PCT增加总体和ER+乳腺癌风险，高MPV增加总体乳腺癌风险，而高PDW与总体乳腺癌及其两种亚型风险降低相关。尽管当前结果提供了因果关系的提示性证据，但它们为乳腺癌风险预测提供了新的见解和方向，挑战了一些先前基于传统观察性研究的观点，并激发了对血小板参数与乳腺癌风险之间关系的进一步探索。

缩写

PLT，血小板计数；MPV，平均血小板体积；PDW，血小板分布宽度；PCT，血小板压积；IVs，工具变量；ER，雌激素受体；MR，孟德尔随机化；GWAS，基因组关联研究；BCAC，乳腺癌协会 consortium；SNPs，单核苷酸多态性；LD，连锁不平衡；EAF，效应等位基因频率；IVW，逆方差加权；MR-PRESSO，MR多效性残差和与异常值；RAPS，稳健调整轮廓评分；TME，肿瘤微环境；VEGF，血管内皮生长因子；PDGF，血小板衍生生长因子；MDSCs，髓源性抑制细胞；NK，自然杀伤细胞。

伦理批准和知情同意

本研究中使用的公开数据来自英国生物银行和乳腺癌协会 consortium，并已获得相应的伦理批准。鉴于本研究未涉及人体或动物实验、观察或干预，因此不需要额外的伦理批准或知情同意。

作者贡献

所有作者对报告的工作做出了重大贡献，无论是在构思、研究设计、执行、数据获取、分析和解释方面，还是在所有 these areas; 参与了起草、修订或严格审阅文章；最终批准了要发布的版本；已同意提交文章的期刊；并同意对工作的所有方面负责。

披露

作者声明在这项工作中没有竞争利益。

数据共享声明

本研究中呈现的数据集可以在公共数据库中找到。