城市土耳其栎根际微生物互作机制：根形态、土壤酶谱与群落组成对城市化梯度的响应

本综述系统探讨了城市化对土耳其栎（Quercus cerris L.）根际微生态的影响，通过根形态分析、土壤酶谱成像（zymography）和微生物群落测序，揭示了城市化梯度下根构型权衡（如根直径增加、比根长降低）与微生物功能（如β-葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶活性升高）的耦合机制，为优化城市绿化策略提供了植物-微生物互作的理论基础。

　　

引言

城市环境作为动态生态系统，其植物与生物/非生物因子的互作对维持生态健康和关键生态系统服务至关重要。城市树木尤其通过减轻空气污染、调节温度和固碳提供多重环境效益，同时作为生物多样性热点贡献于城市生境功能。然而，城市化进程和人类活动显著改变了树木与环境因子的互作，对城市生态系统健康和功能产生负面影响。城市环境以土壤压实、地下基础设施、化学污染和过度热量为特征，形成阻碍根系资源获取和稳定性的挑战性条件，影响树木生长发育。

根际作为植物与环境的关键界面，是植物-微生物互作的热点区域，涉及古菌、细菌、真菌、卵菌、原生生物和病毒等多种微生物。这些互作在亲密性和特性上存在差异，微生物既可促进植物生长和生产力，也可作为病原体显著抑制植物发育。反之，根系分泌物作为初级和次级化合物（碳水化合物、氨基酸、有机酸、生长素）的复杂混合物，充当营养丰富的底物和信号分子，塑造植物微生物组的组成和功能。

根系特性（如长度、直径和生物量）也影响根际细菌群落结构。例如，根长增加可能减少有效氮，从而降低微生物生物量；根直径和细根周转则与增强的根际微生物碳、氮、磷循环代谢活动相关。这些复杂的植物-微生物互作形成“树木中心的全息生物体生态系统”，即宿主及其相关物种组成的独特生态单元，对城市生态系统的长期可持续性至关重要。尽管根际研究在自然和农业生态系统中常见，但城市背景下的研究仍不足，这主要源于根系研究的挑战，包括土壤可及性有限以及与地上部分相比根性状较不明显。这些限制在城市环境中被放大，根系面临空间受限、物理障碍和人行道屏障。

土壤酶谱成像（zymography）等非破坏性方法，结合16S rDNA测序和土壤理化分析，允许将全息生物体功能与城市环境中树木健康和稳定性联系起来。但由于城市环境的复杂性，用于造林物种的选择必须满足与场地特定生长条件、抗逆性和功能作用相关的标准。土耳其栎（Quercus cerris L.）作为欧洲混交林广泛分布的树种，因其对环境胁迫的耐受性而成为重新造林的有希望候选者。尽管其根系动态在自然环境中已有记录，但根系可塑性与整体植物性能之间的联系，考虑环境条件和微生物互作，仍不清楚，尤其是在城市背景下。

城市化程度可能影响土壤酶活性，同时改变土壤微生物群落组成，并引导形态变化和根系适应策略。城乡结合部和城市土壤已显示出重金属、总碳和氮浓度增加，这些变化将改变根际动态，调节根系与生物/非生物组分互作的功能性和稳定性。

本研究在根盒系统中调查了土耳其栎根际互作沿非城市到城市梯度的影响。通过整合酶活性的空间酶谱成像、土壤特性与土耳其栎根性状和微生物群落结构/功能分析，提供了城市化程度如何影响根际互作的全面理解。此类见解不仅有助于增强对城市全息生物体系统的理解，还可通过模拟植物-微生物互作支持城市绿化策略。

材料与方法

采样点

根据意大利国家生物多样性未来中心的方法学协议，在坎波巴索（意大利中部）城市区域选择了三个有土耳其栎良好记录的站点。根据功能城市区域绿色区域斑块的程度和数量，选择了三个不同站点：Bosco Faiete（非城市）、San Giovanni（城乡结合部）和Villino Correra（城市），对应土耳其栎的非城市、城乡结合部和城市森林。非城市森林被纳入“Monte Vairano”特别保护区。

土壤特性

从三个森林站点（非城市、城乡结合部和城市）的0-10厘米表层土壤收集样品，用作后续根盒实验中植物生长的土壤基质。每个采样点收集三个土壤芯进行理化分析，包括pH、总有机碳（TOC）、总氮（N_tot）、氨氮（N_NH3NH4）、氯化物、总磷（P_tot）、有效磷（P_av）以及钠、硼、钾、砷、铜、铅、镍、钴和锌等元素。使用土壤质量指数（SQI）和SQI面积比较了三个土壤的质量。

根盒实验设置

将三种土壤过筛至1毫米，均匀填充塑料根盒，避免分层。土壤湿润至持水能力（WHC）的60%。将九年生土耳其栎幼苗种植到单独根盒中，每个土壤类型三个重复。根盒以约45度角放置，并用铝箔覆盖以避光。植物在气候室中培养14天，维持60% WHC。

根形态分析

从根盒中取出植物，超声清洗去除土壤颗粒，扫描根系图像，使用RhizoVision Explorer分析根性状，包括根尖数量、总根长、网络面积、平均直径、中值直径、最大直径、周长、体积、表面积和比根长（SRL），并测定根生物量干重。

土壤酶谱成像

使用荧光标记底物进行β-葡萄糖苷酶（β-Glu）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）和酸性磷酸酶（Phos）的酶谱成像。膜片浸泡底物后置于土壤-根表面，孵育1小时后成像。通过校准将灰度值与酶活性关联，进行热点和共定位分析。

根际和 bulk 土壤酶测定

分离根际和 bulk 土壤，制备土壤悬浮液，在96孔板中测定β-Glu、LAP和Phos活性。使用Michaelis-Menten曲线拟合确定K_m、V_max和催化效率（K_a）。

微生物群落分析

使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒提取根际和 bulk 土壤DNA，进行全长16S rRNA基因测序（Oxford Nanopore Technologies）。使用Kraken2和Bracken进行物种丰度分析，基于Bray-Curtis度量进行β-多样性分析，使用PICRUSt2预测功能谱。

软件和统计分析

使用R进行ANOVA、Tukey HSD检验、Pearson相关、PCA和PCoA分析。数据以均值±标准差表示，显著性水平α=0.05。

结果

土壤性质和质量

三个土壤在化学特性上存在显著差异。城乡结合部和城市土壤显示更高pH、TOC、N_tot和氨氮水平，以及某些金属（钴、砷、镍、铅）和元素（氯、钾、钠）浓度。非城市土壤具有最高SQI（10），城乡结合部土壤SQI面积最小（1.77）。雷达图分析显示选定污染物（砷、氯化物、铬、钴、铜、铅、镍、锌）的差异。

根形态分析

根性状显示显著改变。从城市到城乡结合部和非城市土壤，根尖数量显著增加。总根长、比根长和周长也呈相同趋势，非城市土壤值最高。相反，最大根直径、体积、表面积和网络面积呈反比关系，非城市土壤值最低。平均和中值根直径无统计差异。PCA图清楚区分了非城市与城乡结合部和城市土壤生长的植物。

酶谱成像：从热点分析到共定位

热点分析显示三种酶（β-Glu、Phos、LAP）活性模式相似。非城市土壤酶活性最低，城乡结合部土壤最高。ANOVA显示土壤间β-Glu和LAP活性显著差异，城乡结合部与非城市土壤差异显著。酶活性受土壤和酶类型影响，但互作不显著。尽管缺乏整体共定位差异，但观察到某些酶的空间共现。Pearson相关显示β-Glu与LAP以及Phos与LAP热点在城乡结合部和城市土壤中显著共定位。重叠系数（OC）分析显示酶共定位无显著差异。

根际和 bulk 土壤酶活性变化

动力学参数分析显示三个站点根际和 bulk 土壤存在显著差异。对于β-Glu，城乡结合部和城市土壤V_max更高，城乡结合部土壤K_a值最高。非城市土壤K_m值最低，表明低底物浓度下效率高。Phos活性在城乡结合部土壤最高，根际活性显著高于 bulk 土壤。LAP活性遵循相同站点趋势，但根际和 bulk 土壤无显著差异。

微生物群落

细菌群落分析产生9,356,587条最终读数。共鉴定36门、3210属、11202种，其中7门、82属、137种贡献至少0.50%读数。主要细菌门包括酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、浮霉菌门、变形菌门和疣微菌门。变形菌门在所有样本中占比最高（39.67%-43.65%）。非城市土壤厚壁菌门和疣微菌门比例更高，城乡结合部和城市土壤酸杆菌门和放线菌门更丰富。主要属水平组成因土壤类型而异。PCoA基于Bray-Curtis异同度量显示三个区域细菌群落明显分离，非城市土壤群落与城乡结合部和城市土壤分开。根际和 bulk 土壤群落比较显示非城市样本区别更大，城乡结合部和城市样本重叠更多。ANOSIM揭示不同研究区域根际和 bulk 土壤样本存在显著差异。差异丰度分析显示物种丰度变化。PICRUSt2功能预测显示不同城市区域微生物群落功能组成显著变化。

根性状、酶活性、微生物群落和土壤参数间互作

PCA和Pearson相关分析35个特征，包括酶活性、土壤化学参数、根性状和细菌门相对丰度。分析证实不同土壤细菌群落分组明显。酶活性与土壤微生物群落强烈相关，后者与土壤参数关联。放线菌门与β-Glu、LAP和Phos活性呈强正相关，酸杆菌门与LAP活性正相关。相反，β-Glu、LAP和Phos活性与厚壁菌门和变形菌门负相关。细菌门相对丰度值与土壤胞外酶活性和化学参数相关。β-Glu、Phos和LAP酶活性与TOC、N_tot、N_NH3NH4和铅呈强正相关。铜与β-Glu和LAP显著正相关。

讨论

本研究证明根盒系统结合植物中心的全息生物体分析方法为研究根际植物-微生物互作提供了快速工具。整合根形态性状测量与土壤化学性质、酶活性和微生物群落分析，有效探索了来自坎波巴索三种不同土壤的根际动态。非城市和城市土壤以砂岩和砾岩为特征，城乡结合部土壤以长石石英砂岩为特征。SQI和SQI面积分析表明三个土壤存在不同程度的人为损害。非城市土壤退化最少，城市和城乡结合部土壤某些金属（钴、铅、镍）浓度增加，砷仅在城市土壤升高，反映更大的城市化压力。但金属浓度低于意大利法定污染限值。

城乡结合部和城市土壤还富含TOC和氮（总量和有效量），这可解释土耳其栎根功能性状、土壤微生物群落组成以及根际和 bulk 土壤相关酶活性的某些变化。城市化通常增加土壤碳和氮含量。土耳其栎植物似乎在城乡结合部和城市土壤上 favor robust 根系发育（大直径、扩展表面覆盖、增加根网络面积和体积）。生长在非城市土壤（贫碳、氮和污染物）的植物显示最高比根长，该参数通常与更高效的根系 per unit root mass 相关（高根尖数量、比根长和周长；从探索到利用策略）。根直径和比根长常被认为是评估植物环境适应能力的重要特征。

先前研究还表明，土壤氮有效性增加调节根系可塑性，诱导根数量、比根长、根组织密度降低和根直径增加。给定土壤体积的空间根覆盖通常通过细根在营养丰富热点增殖增加根长和根尖数量。然而，这些资源高效根可能导致高根周转率。比根长作为由根直径和组织密度决定的复合性状，受内部植物构建权衡控制。

根直径较大的植物更 equipped for 广泛横向和垂直根系扩张，这可加速有机材料分解和土壤氮矿化。植物常见策略是优先特定土壤过程，直接通过释放酶，或间接通过影响微生物丰度和/或活性。城乡结合部和城市土壤根际β-Glu和LAP酶活性高丰度和空间分布可能 case in point。尽管先前报道经验相关，β-Glu、LAP和Phos活性增加不能 adopted as indicators of 土壤碳、氮或磷循环异质过程，这些取决于多种酶活性和生理因素。然而，作为水解酶，其活性变化部分指示不同站点和土壤植物和微生物养分可用性差异。

特别是在城乡结合部和城市土壤，易用TOC可能导致微生物底物更快代谢，与 bulk 土壤相比根际热点β-Glu的V_max增加。通常，热点中β-Glu的更高V_max表明酶活性受底物可用性影响。在城乡结合部土壤，更高β-Glu K_a值指示更快更高效碳水解，而非城市土壤更低K_m表明低底物浓度下更大酶效率。城乡结合部土壤 similarly high phosphorus activity（V_max）指示有机分子磷释放更快速率。尽管非城市土壤总磷水解能力较低（低V_max），但更低K_m值和更好催化效率（K_a）证明低底物水平更高效磷利用。根际和 bulk 土壤磷活性也显著不同；根际酶活性最高， bulk 土壤更高K_m和更低底物亲和力。LAP活性遵循相同站点趋势，指示高效氮水解，但根际和 bulk 土壤无显著差异。慢生长微生物（K-策略者）通常具有高底物亲和力酶，允许其在有限底物上生存。这种适应降低其与具有更高K_m值的快生长微生物（r-策略者）竞争力。

尽管所有土壤主要细菌门一致存在（酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、浮霉菌门、变形菌门和疣微菌门），但其相对丰度值不同。非城市土壤厚壁菌门和疣微菌门丰富，城乡结合部和城市土壤酸杆菌门和放线菌门丰富。变形菌门是所有检查样本中最 represented 门，拟杆菌门和浮霉菌门丰度较低。先前研究强调酸杆菌门、放线菌门、变形菌门和疣微菌门是城市土壤微生物群中的优势门。放线菌门在根际经常 dominant，贡献于土壤系统功能，在植物残体分解中通过多种水解酶发挥关键生态生理功能。它还以编码固氮和抗生素生产的基因 characterized，可增强营养源竞争力。此外，放线菌门已显示促进植物生长，并在细根分解中 crucial。

酸杆菌门在植物-土壤生态系统中也具有显著生态作用，积极参与碳、氮和硫生物地球化学循环。基因组研究强调了酸杆菌门成员的碳水化合物利用潜力，显示存在编码参与复杂聚合物（如纤维素、半纤维素、几丁质、木聚糖和木质素衍生物）降解的酶基因；这暗示酸杆菌门作为分解者在土壤和植物、真菌和昆虫来源有机质循环中的积极参与。此外，酸杆菌门基因组宿主调节硫代谢和干预氮循环的基因。另外，许多酸杆菌门物种产生的胞外多糖有助于土壤基质形成，并通过使植物更容易吸收营养和水促进植物生长。这加强了这些细菌在创建植物和土壤之间有益互作中的生态生理作用，这在城市生态系统中特别关键。

众多研究还得出结论，植物-微生物互作可由根形态性状调节。Choudhury等人研究指示反硝化活性与根生物量正相关，而与根直径负相关。其他研究证明细根富含丰富微生物类群，而某些门（如拟杆菌门）在细根中 dominant。尽管这里未发现某些根性状与细菌相关，但酸杆菌门和放线菌门与城乡结合部和城市土壤中发现的最髙β-Glu、LAP和Phos活性正相关（特别是放线菌门与β-Glu、LAP和Phos热点活性，酸杆菌门与LAP）。作为对应和全面作为“根际效应”，城乡结合部和城市土壤中发现的高β-Glu和LAP酶活性与土耳其栎根直径增加和比根长降低相关。根直径更厚和比根长更低的根投资更多于微生物共生体，遵循“外包”策略，增加碳分配；因此微生物不经历根竞争营养资源的应激，这可能有利于土壤微生物增殖。城市干扰通常导致微生物组成和功能性状均质化，帮助维持基本生态系统功能，如碳和营养循环。因此，根系分泌物可能帮助在微生物多样性常减少的（城乡结合部）城市土壤中重新建立微生物 niche，支持土壤微生物生物量和酶活性。

PICRUSt2分析支持酸杆菌门和放线菌门参与营养循环，揭示城乡结合部和城市土壤中特定代谢相关活动（包括碳固定、氧化磷酸化、光合作用以及甲烷、氮和硫代谢）。然而，尽管本研究未分析真菌群落，但应注意植物根也是土壤真菌的理想 niche，其在根际作为腐生菌或与光合植物关联的菌根共生体生活。除细菌外，真菌是森林土壤营养循环的主要驱动者，产生参与有机质分解和矿化的多种胞外酶。因此，尽管需要进一步研究揭示其参与的确切程度，但合理假设土壤真菌可能参与支持提到的酶活性。据报道，厚壁菌门（包括抵抗极端环境变化的物种）在增加人为/城市压力下显示相对高百分比。相反，我们的测序结果强调该门在非城市土壤中的相对丰度值高于城乡结合部和城市土壤。厚壁菌门内，芽孢杆菌物种通过贡献氮和碳生物地球化学循环在保护土壤健康中起重要作用。该门其他属已被描述为植物生长促进根际细菌，通过激素模式变化引导细根/根毛发育。

考虑非城市土壤中发现的细胞过程（如细胞生长和死亡）和防御机制相关通路（如异生物降解和代谢、萜类和聚酮代谢等）的强 representation，可假设微生物物种间高竞争（增加抗生素生产和抵抗），可能 due to 这里发现的土耳其栎高比根长。高比根长和根密度增加根-土壤界面，为微生物创建更多微生境。然而，发现中值根直径、比根长与酸杆菌门/放线菌门相对丰度值之间强负相关。这与先前研究一致，发现更高放线菌门丰度在根更长植物中。相反，直径细和比根长高的根，如非城市土壤生长的土耳其栎，通常与短寿命和快速根周转相关。此外，它们为富营养细菌（如变形菌门）和腐生菌提供更多资源。另一方面，直径细的根也可能限制根相关微生物定植可用区域，并与土壤微生物竞争营养。这可解释非城市土壤中寡营养微生物（如疣微菌门）的丰度，通常由低土壤干扰引起，增加主要营养循环。确实，疣微菌门（其存在在城市公园已有记录）是寡营养微生物，通常慢生长且良好适应低营养浓度土壤。

分析根际和 bulk 土壤微生物群落差异，在城乡结合部和城市土壤中，它们倾向于趋同 towards 更相似组成。相反，非城市土壤样本观察到更大区别，根际和 bulk 土壤细菌类群相对丰度发现显著变化。然而，这些差异未反映在微生物群功能中，因为无功能类别显示显著改变富集。因此，可能根际和 bulk 土壤中发现的属于不同类群的物种执行相同功能，相互补偿。

总体，尽管我们不能解开根或微生物活动在保证（城乡结合部）城市根际功能中的贡献，但我们可以推测土耳其栎策略调整根形态和分泌物可能诱导转变微生物组成，反之亦然，创建连续反馈环 able to 确保异质退化城市土壤中营养动员。这些有趣观察需要进一步调查，可提供根际内发生空间互作的更深见解。

结论和未来展望

根盒系统中进行的调查为我们全面理解城市根际动态与根形态性状、微生物群落组成和酶活性关系提供了宝贵贡献。我们可以提出，某些根表型性状变化可能作为调节植物-土壤需求不匹配的主要反馈机制。然而，根相关微生物也可通过双向关系修改根系本身，创建连续反馈环。

土耳其栎幼苗在（城乡结合部）城市土壤上发现的更大根直径可能加速有机质和氮分解。这些植物还可能通过改变分泌物组成投资更多于微生物共生体。此外，根际和 bulk 土壤微生物群落在城乡结合部和城市土壤中倾向于趋同 towards 更相似组成，而更大微生物群分离 characterized 非城市土壤中检索的微生物群落。这可能与三个土壤的植被覆盖和土壤化学性质与组成差异相关。

尽管提出了城市、城乡结合部和非城市环境中可能发生的根际互作的全面概述，但理解其性质和动态仍存在多重限制。城市土壤由于多样土地利用历史在空间和化学上高度异质。根性状也响应土壤条件、水/营养可用性和微生物关联显示高可塑性。这些缺点不可避免地可能导致功能关系误解或季节效应过度泛化。另一个限制与宏基因组学方法相关，其在定义占据合理明确生境的微生物群落方面强大，但由于记录细菌与地球细菌物种估计相比百分比低，价值有限。然而，多亏“地球微生物组计划”，2010年开始了一项显著努力以特征化跨陆地、海洋、淡水、沉积物、空气和构建环境 gathered over 30,000样本的微生物生态系统多样性、分布和结构。这预计也将增加来自包括在NBFC项目中的多个城市、城乡结合部和