新型糖基转移酶UGT75AJ2的全面工程化：实现高效、供体广谱及区域选择性黄酮糖基化

本研究针对UDP-糖基转移酶(UGT)在黄酮糖基化中存在的酶活性低、区域选择性差和底物谱窄等瓶颈问题，通过结构导向的蛋白质工程策略，对蓝莓来源的UGT75AJ2进行定向进化，成功获得催化效率提升128倍的突变体Mut4-1，并拓展了其糖供体兼容性和区域选择性，为天然药物研发提供了高效生物催化工具。

　　

黄酮类化合物作为植物次生代谢产物，在人类健康领域展现出巨大的药用潜力，具有抗菌、抗炎、抗氧化、免疫调节和抗癌等多种生物活性。然而，这些化合物的治疗效果很大程度上取决于其糖基化修饰程度。黄酮糖苷不仅能够改善母核化合物的溶解度和稳定性，还能显著增强其药理活性和生物利用度。尽管化学糖基化方法存在步骤繁琐、特异性差和产率低等问题，生物催化糖基化为此提供了环境友好的替代方案。尿苷二磷酸(UDP)依赖的糖基转移酶(UGT)在黄酮糖苷的生物合成中起着关键作用，但大多数野生型UGT面临着酶活性低、区域选择性差和底物范围有限等挑战，严重限制了其在制药领域的应用。

为了突破这些技术瓶颈，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》上发表了一项突破性研究，通过对蓝莓(Vaccinium corymbosum)中鉴定到的新型糖基转移酶UGT75AJ2进行系统性的蛋白质工程改造，成功解决了上述问题。

研究人员采用转录组测序和功能分析从蓝莓成熟和未成熟果实中鉴定出六个花青素糖基转移酶，其中UGT75AJ2因其最高表达水平和显著差异表达被选为研究对象。通过系统发育分析表明该酶属于黄酮5-O-糖基转移酶簇群。研究人员通过基因克隆、异源表达和蛋白纯化获得重组酶，并证实其能够以C3G(cyanidin-3-O-glucoside)和槲皮素(quercetin)为底物催化3′-O和7-O位点的糖基化反应。

关键技术方法包括：基于AlphaFold2、RoseTTAFold All-Atom和同源建模的结构预测；全原子显式溶剂分子动力学(MD)模拟验证；分子对接鉴定约70个关键突变热点；虚拟饱和突变能量计算；基于序列保守性分析的热点残基筛选；以及多轮迭代饱和突变(ISM)和组合突变策略。

在增强UGT75AJ2催化活性方面，研究人员首先通过计算机辅助方法识别突变热点。利用虚拟筛选和迭代突变策略，他们设计了突变体Mut4-1(S367A/V274A/F82V/I132T)，其相对催化活性提高了128倍。分子对接和MD模拟显示，Mut4-1复合物中的氢键和疏水相互作用增加，活性位点灵活性增强，底物结合口袋体积增大，这些结构变化共同促进了催化活性的提升。

在拓宽底物谱研究中，研究人员评估了UGT75AJ2及其突变体对36种具有药用潜力的黄酮类化合物的糖基化能力。与野生型相比，Mut4-1表现出更优越的催化效率，能够有效糖基化29种黄酮底物，涵盖花青素、黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷酮、黄烷酮醇等多个亚类。

在扩展糖供体兼容性方面，研究人员通过结构基础的蛋白质工程方法，成功改造了UGT75AJ2的糖供体结合区域。通过比较五个区域(A至E)的残基与其他高广谱性糖基转移酶的差异，他们构建了三重突变体S14G/F366H/S367G。该突变体对UDP-Gal、UDP-GlcNAc和UDP-Xyl的利用能力显著改善，特别是以芹菜素(apigenin)为底物时，对UDP-GlcNAc和UDP-Xyl的利用率接近100%。

在增强区域选择性方面，研究人员采用FRISM组合突变策略，成功获得了对C3G的3′-O和7-O位点具有高度选择性的突变体。其中，三重突变体Y75E/F185Y/I132T对3′-O位点的选择性达到99%，转化率为93%；而L112F/M273E/S367D对7-O位点的选择性为85%，转化率为80%。值得注意的是，S367F突变体首次实现了对C3G的5-O位点糖基化，这一活性在野生型和其他突变体中均未观察到。

研究结论表明，这项研究在O-糖基转移酶蛋白质工程领域取得了显著进展。通过整合虚拟筛选和结构导向的酶修饰定向进化策略，研究人员开发出了强大、快速且多功能的方法来增强酶功能。这种方法不仅提高了催化效率，还扩展了糖基供体谱并增强了糖基转移酶的区域选择性，为具有治疗潜力的天然黄酮糖苷的靶向高效生产提供了重要技术支持。

讨论部分强调，这项研究的创新之处在于开发了一种定制化的FRISM进化策略，该方法避免了传统定向进化中繁琐的高通量筛选步骤，大大缩短了实验周期并降低了劳动强度。工程化的UGT75AJ2突变体在催化效率、底物广谱性和区域选择性方面的显著改善，为天然蓝色色素和高价值黄酮糖苷的生物合成提供了强有力的工具，在生物制药、功能性食品和植物育种等领域具有广阔的应用前景。