冷冻电镜解析古菌dsDNA病毒HFTV1近原子分辨率结构揭示其从头部至尾部的感染机制

本研究通过冷冻电镜技术首次解析了极端嗜盐古菌病毒HFTV1的完整近原子分辨率结构，揭示了其衣壳组装、DNA盘绕模式及尾部构象转变的分子细节。该研究不仅阐明了古菌病毒与细菌、真核病毒在进化上的联系，还为理解病毒-宿主相互作用及感染机制提供了关键结构基础，对病毒进化史和生物防治策略具有重要启示意义。

　　

在微生物世界中，病毒的数量远超宿主至少10倍，是地球上最丰富的生物实体。其中，古菌病毒展现出惊人的形态多样性，包括螺旋形、瓶形和纺锤形等。特别引人注目的是，许多古菌病毒与感染细菌的有尾病毒（tailed viruses, TVs）具有显著的相似性，这引发了关于所有有尾病毒是否共享共同起源以及它们是否以类似方式感染宿主的根本性问题。回答这些问题需要高分辨率的结构信息，然而在此之前，尚无完整的古菌病毒原子模型可用。

极端嗜盐古菌病毒Haloferax tailed virus 1 (HFTV1)成为解决这些问题的关键。古菌有尾病毒（arTVs）与细菌有尾病毒（baTVs）在进化上相关，并与它们一起被归类于有尾病毒纲（Caudoviricetes）。尽管比较基因组学表明古菌和细菌有尾病毒在远古时期就已分化，但它们的共同结构和保守蛋白（尤其是主要衣壳蛋白MCPs）表明了它们之间的进化联系。基于有尾病毒的广泛分布，它们被认为是最后 universal common ancestor（LUCA）病毒组的一部分。

然而，与细菌有尾病毒相比，古菌有尾病毒的感染和组装机制研究较少。最近研究发现，两种古菌病毒的受体是S层蛋白（S-layer protein），这是古菌细胞包膜的主要组成部分。研究表明，HFTV1通过其尾部吸附到宿主Haloferax gibbonsii LR2-5上，但也通过其头部吸附，这种不寻常的结合机制的功能意义由于缺乏结构信息而一直难以捉摸。

在这项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究中，研究人员通过纯化HFTV1病毒颗粒并利用冷冻电镜（cryo-EM）研究其结构，通过单颗粒分析获得了DNA填充和空病毒颗粒的近原子分辨率图谱，从而能够组装病毒在DNA释放前和后的完整原子模型，包括所有结构蛋白组件。

研究人员主要运用了冷冻电镜单颗粒分析技术（cryo-EM single-particle analysis）、对称性扩展和局部重构技术（symmetry expansion and localized reconstruction）、聚焦分类和精修（focused classification and refinement）、质谱蛋白质组学分析（mass spectrometry proteomic analysis）以及AlphaFold2结构预测等技术。病毒样本来源于Haloferax gibbonsii LR2-5宿主培养物。

结构与结果

HFTV1病毒颗粒在DNA弹出前后的结构

研究发现样品中含有DNA填充的颗粒以及已经弹出DNA基因组的颗粒，这两类颗粒在二维分类中很容易区分。最终获得的整个感染性DNA填充病毒颗粒的全局分辨率为4.39 ?。为了获得其组成部件的更高分辨率，对头部、塔楼结构、门户、尾部、基板和尾纤维进行了使用与每个子结构相关的对称算子的聚焦精修。组合数据允许构建整个病毒颗粒的原子模型。

全长原子结构显示，该病毒长度为1350 ?，具有一个直径约600 ?的二十面体头部。头部装饰有多达60个塔楼结构，这些塔楼突出衣壳表面约90 ?，从而将其直径增加到约780 ?。尾部长度为560 ?，终止于一个基板，带有三个辐射状的尾纤维（TFs），长度约190 ?。

与DNA填充的对应物相比，空病毒缺少 tape measure protein (TMP)、baseplate hub (BPH)和尾纤维(TFs)，表明这些部分在DNA弹出过程中被抛弃。然而，尾管的长度没有改变，表明它在DNA弹出过程中不收缩，类似于感染细菌的siphoviruses。此外，填充和空病毒的头部没有显示显著差异，表明DNA释放不会导致头部的任何结构变化。

头部具有右手T=7二十面体对称性并饰有塔楼结构

二十面体对称平均产生了2.36 ?的图谱，用于构建原子模型。衣壳形成一个右手（dextro）二十面体，三角剖分数T=7（h=2，k=1），由七个蛋白质不对称重复单元的60个拷贝组成。T=7二十面体准对称性是几种细菌siphoviruses的特征。然而，HFTV1衣壳的手性是不寻常的，因为大多数已解析的T=7二十面体衣壳结构都显示左手（levo）对称性。

衣壳的基础层由gp19，即主要衣壳蛋白（MCP）组成。MCP形成交替的五聚体和六聚体，通过不对称三聚体相互作用。在每个三聚体中，MCPs采用三种不同的构象。在门户周围，MCP的构象再次与三聚体中的不同，以适应衣壳-门户界面。在整个衣壳中，发现了13种不同的MCP构象。

DALI显示HFTV1 MCP在结构上类似于有尾噬菌体的MCPs。HFTV1的MCP与基因组预测的蛋白质序列相比缺少N端氨基酸1至100，表明该蛋白质在成熟过程中可能经过翻译后处理。缺少前100个氨基酸后，HFTV1 MCP符合经典的HK97折叠。MCP的内表面高度带负电荷，这被认为可以防止包装的DNA粘附到衣壳上，从而促进感染时的快速释放。

三聚体MCP界面被gp18的三聚体结合，即衣壳稳定蛋白（CSP）。在整个二十面体衣壳上，这些CSP三聚体排列成一系列六边形和五边形环，分别与二十面体的面和顶点重合。HFTV1 CSP结合每个MCP三聚体的外表面，从而稳定衣壳结构。

揭示了头部内的dsDNA包装

为了阐明dsDNA在衣壳内的组织，研究人员通过从不对称衣壳重建中减去蛋白质信号来分离dsDNA密度，然后使用CryoSPARC进行3D精修。为了增强最内层DNA区域以及门户附近和相对衣壳极区域的分辨率，进行了聚焦粒子减法和分别精修这些区域。

分析显示dsDNA排列成10个同心壳层。研究人员观察到dsDNA的两个末端：一个通过门户延伸，另一个可能位于最外层壳，环绕门户的圆周。门户附近的dsDNA分辨率比其他衣壳区域更好，特别是在邻近门户近端塔楼的六边形衣壳面附近。这些六边形顶点可能作为锚定点，促进dsDNA包装协调。dsDNA的扭曲和碱基对清晰可见，符合典型的B-DNA结构。

与其他dsDNA病毒如siphoviruses和herpesviruses类似，HFTV1显示出紧密包装的DNA层，外层和门户周围分辨率更高。衣壳中央区域显示出比外层更密集的DNA包装，可能表明一个特化区域或存在货物蛋白质。掩膜精修证实这个密集的中央区域主要由DNA组成，特别是两个最内层（第9和第10层）比外八层包装得更紧密。

总体而言，HFTV1显示左手DNA盘绕，类似于在herpes simplex virus 1 (HSV1)和Bacteroides intestinalis virus ΦcrAss001中看到的情况。从门户相邻的末端开始，DNA形成盘绕的层，相对于衣壳"赤道"或与门户基座平行的轴倾斜约17°。dsDNA链内和跨第1至第7层的中心到中心间距约为25 ?，与之前观察到的dsRNA盘绕一致，其中层内间距约为26 ?。然而，dsRNA的层间间距更宽（约29 ?），表明HFTV1中的dsDNA包装得更紧密。

塔楼拥有保守的脱乙酰酶样结构域

每个六边形MCP构成一个塔楼的基础。在衣壳的二十面体和不对称重建中，塔楼头部分辨率较差，表明其具有灵活性。为了提高塔楼图谱的分辨率，使用了局部重建技术。颗粒在头尾轴的五重对称周围进行对称扩展，采样五个特别明确的邻近门户的塔楼复合物。三重旋转（C3）平均聚焦于单个塔楼位置，产生了2.36 ?分辨率的图谱。

塔楼由两种独立的蛋白质组成：一个由gp30六聚体[塔楼基座蛋白（TBP）]形成的基座和一个三聚体的塔楼头部蛋白（THP）gp31。值得注意的是，TBP密度包含的氨基酸比先前注释的基因组所提示的要多。

TBP六聚体和THP三聚体都具有蘑菇状结构。TBP通过一个短的茎插入MCP六聚体，该茎由一个六链β-桶形成。广泛的Mg²⁺离子配位（每个TBP亚基两个离子）稳定了TBP和MCP之间的相互作用。然后THP三聚体以一个更长的12链三角桶插入TBP六聚体，将THP提升到TBP之上。在六聚体-三聚体界面发现了六个组氨酸修饰（可能是磷酸组氨酸）。

除了三个Mg²⁺离子外，THP三聚体还包括三个催化Zn²⁺配位位点。使用DALI和NCBI BLAST分析THP的结构表明，THP与多个物种的多糖脱乙酰酶具有相似性。将THP的结构与Mycobacterium smegmatis的多糖脱乙酰酶（PDB-3RXZ）的结构叠加，结果显示两种蛋白质的催化域紧密匹配。

门户及其在衣壳中的整合

门户是gp13（PP）的一个十二聚体，跨越衣壳的一个五边形顶点。研究发现MCP五聚体和PP十二聚体之间的对称失配由中介门户界面蛋白gp21（PIP）接口。将PIP建模到衣壳-门户界面的不对称重建中显示，其注释的基因组序列短了八个残基，表明起始甲硫氨酸与最初注释的不同。

在门户-衣壳界面，一个MCP结合的镁离子被PIP的一个精氨酸取代。此外，PIP在位置17也有一个推定的磷酸组氨酸残基，它与相邻的MCP单体形成稳定氢键。

十二重旋转平均产生了2.34 ?分辨率的PP图谱。在成熟病毒粒子中，dsDNA的末端通过PP的中央通道突出，该通道内衬有一圈推定的磷酸组氨酸残基。这些残基将为门户隧道增加负电荷，可能不利于任何DNA与门户的结合，从而促进感染期间的快速DNA释放。研究人员没有观察到先前在其他PP中报道的带正电荷的环，这些环被认为在易位过程中防止DNA回滑或尾附件前稳定衣壳内的DNA。这些环的缺失表明HFTV1中实施了不同的回溯停止机制。

比较DNA填充和空衣壳的门户结构显示，后者有一个塞状密度，前者没有。PP本身的结构在两个状态之间没有显示实质性差异，表明该蛋白质不需要大规模构象变化来促进DNA释放。

尾部和TMP的完整结构

以尾部为中心的颗粒经过C3对称精修，分辨率达到2.45 ?。尾部区域开始于十二聚体的gp26[头尾连接器（HTC）]，它与PP相互作用以维持DNA可以通过的管道。随后是六聚体的gp29[尾部完成蛋白（TCP）]，然后是11个六聚体的gp35[尾管蛋白（TTP）]组成尾部的主体。尾部的每个六聚体段与下一个之间有23.6°的旋转偏移。

尾部形成一个直径36 ?的空心隧道。在DNA填充的病毒中，这个隧道容纳gp40（TMP），一个六聚体 coiled-coil 结构，具有交替的C端构象。TMP从门户附近的第一个TTP的中央通道延伸到gp44[基板毂（BPH）]的一个空腔。

基于图谱，研究人员可以将TMP构建为一个完整的原子模型，所有侧链都存在。TMP的C端（残基317至341）在密度中明确界定，奇数亚基形成α-螺旋结构停靠在BPH中，而偶数亚基形成β-链结构向后折叠朝向N端。对于奇数和偶数TMP亚基，残基2至316折叠成α-螺旋结构。这些束成一个具有三重对称的六聚体 coiled-coil，跨越大部分尾部长度。

在TMP的延伸N端部分，密度在各种区域仍然模糊，可能是由于灵活性，侧链分辨率较差。TMP的coiled-coil区域与11个尾管环精确对齐，证实其长度决定了尾管长度。随着coiled coil在C端区域解开，它可能指导尾部终止蛋白质的添加。具体来说，三个向后折叠的TMP末端与三聚体的基板-尾连接器（BTC; gp41）相互作用，而三个延伸的末端与三聚体的BPH蛋白质接合。这种解开因此也促进了从六聚体TMP对称性到三聚体BTC和BPH的转变。

PP通道内的一个 elongated 密度明显对应于dsDNA。此外，研究人员在DNA和TMP之间观察到两个密度，位于TCP和HTC蛋白质内。使用AlphaFold3，研究人员预测了所有功能未知的短HFTV1蛋白质的 oligomers 结构，结果显示gp14的二聚体是该密度的最佳匹配。gp14二聚体形成两个球状结构域，一个在N端，另一个在C端，由短环区域连接。由于TMP的三重对称特征强烈，研究人员无法基于gp14和相邻DNA的较弱特征对齐颗粒，导致该区域二级结构细节被平均化。然而，将gp14二聚体作为刚性体叠加产生了合理的拟合。由于其位于TMP和DNA之间，研究人员将该蛋白质命名为TMP-DNA间隔子（TDS）。在空病毒中，TMP和TDS缺失，表明它们在DNA弹出过程中被释放。

BPH形成带有三个TFs的不对称三聚体

最终的TTP六聚体之后是三聚体的BTC，后者又与三聚体的BPH接口。值得注意的是，BTC蛋白质是一个伪六聚体三聚体：每个亚基由两个同源结构域组成，这些结构域可能通过基因复制和融合事件产生。

BPH配位Mg²⁺和K⁺离子，这些离子可能有助于复合物的稳定性，并通过一个三角环与BTC连接，从该环突出三个球状结构域。奇怪的是，这些结构域显示不对称配置。虽然其中两个结构域彼此结合，但一个仍未结合。由于这三个结构域的结合界面相同，可以假设它们可以自由互换。这表明三个BPH结构域可能经历动态的结合和解结合循环，这可能有助于病毒的对接或穿透S层。

BPH还锚定三个TFs。TFs连接到每个BPH亚基的N端，并以约45°的角度辐射 away。这种相互作用通过广泛的氢键和Mg²⁺离子配位稳定。DynaMight分析显示，TFs相对于BPH高度灵活，可能有助于它们停靠在细胞表面的S层上。

TFs由gp42[TF蛋白（TFP)]的同源三聚体形成。三个TFP聚集形成一个基座，随后是一个β-螺旋、一个茎和一个头部。TFP配位Mg²⁺和Zn²⁺离子，这可能稳定三聚体界面。根据DALI，BPH显示与木聚糖酶和糖胺酶的某些结构相似性。对于TFP，DALI提示与Clostridium perfringens的CspB蛋白酶（PDB-4I0W）有某些相似性，尽管Z值非常低。这可能暗示BPH和TFP在结合H. gibbonsii表面聚糖或甚至降解S层中发挥作用。

配位的镁离子对病毒粒子稳定性至关重要

为了测试在整个BPH、TFP、塔楼和HTC蛋白质中协调的多个分子内和分子间Mg²⁺离子是否具有稳定作用，研究人员使用螯合剂从感染性病毒颗粒中去除Mg²⁺。这导致感染性丧失和病毒颗粒碎片化，表明Mg²⁺配位有助于结构完整性。衣壳内广泛的离子结合可能是HFTV1在高盐环境中进化的结果，那里Mg²⁺离子丰富。

HFTV1与古菌和细菌TVs的保守性和分化

尽管HFTV1感染古菌，其整体结构惊人地类似于细菌siphoviruses。为了调查HFTV1是否与噬菌体相关，研究人员使用DALI服务器对HFTV1的每个组成蛋白质进行了结构相似性分析。对于大多数HFTV1结构蛋白质，确定了与噬菌体蛋白质的可能同源性（Z值在8到20之间）。这些包括（按Z值降序排列）MCP、THP、TCP、CSP、TTP、BTC和TFP。

DALI提示HFTV1的PP和BPH是噬菌体对应物的明确同源物（Z值>20）。最高的Z值分别在Thermus phage G20c门户（PDB-4ZJN；Z值20.2）和原噬菌体MuSo2 43-kDa尾部蛋白质（PDB-3CDD；Z值20.1）中确定。

对于HTC，确定了相似性但没有明确同源性，而PIP根本没有结构相似性命中，表明衣壳的这一部分具有独特起源。THP也没有显示与噬菌体蛋白质的任何同源性，而是与细菌多糖脱乙酰酶同源（与Mycolicibacterium smegmatis MC2 155的酶的Z值最高为18.6；PDB-3RXZ）。另一个引人入胜的可能同源物是在白蚁物种Trinervitermes trinervoides的内切-1,4 β-木聚糖酶中发现的[PDB-7AX7；Z值18]。对于TBP，只能确定一个可能同源物，来自Bacillus subtilis strain 168的噬菌体样元件PsbX蛋白质[PDB-6IA5；Z值8.1]。

这些数据提示HFTV1可能直接进化相关于有尾噬菌体，核心结构蛋白质，特别是那些形成门户、衣壳、尾部、基板和TFs的蛋白质，可能是细菌和古菌病毒之间水平基因交换的产物。其他传递对古菌宿主特定适应的蛋白质，如THPs，似乎专门为HFTV1进化。

讨论与结论

对HFTV1病毒粒子的结构分析揭示了推定的聚糖结合位点，结合先前对颗粒附着的观察，表明了一个多步骤的病毒吸附机制。研究人员提出HFTV1最初通过THP推定的N端碳水化合物结合模块可逆地粘附到宿主聚糖上，该模块形成塔楼的最外层区域。同时，THP的C端区域具有预测的糖苷脱乙酰酶/水解酶活性，将修饰宿主的聚糖基质，可能削弱H. gibbonsii的保护性表面层晶格。可以想象，在这个过程中，新的结合位点被揭示，在病毒重新定向后促进基板锚定。

基板作为细胞膜上的锚定点，将病毒颗粒牢固地固定在宿主细胞上。这种通过基板的附着在许多其他病毒中是不可逆的，重新定向病毒使得尾部轴垂直于细胞表面对齐。BPH的C端包含一个预测的碳水化合物/半乳糖结合域，可能与S层上剩余的聚糖残基或嵌入膜中的脂质-聚糖载体相互作用。潜在动态的基板结构可能以锁钥机制运作，打开或破坏S层蛋白质之间的相互作用，为病毒基因组传递创建路径。

尾部长度为560 ?，足以跨越S层和细胞膜之间的距离，在Haloferax volcanii中约为200 ?，在H. gibbonsii中可能类似。这使得病毒能够穿透S层和膜。在BPH和尾纤维解离后，形成从病毒门户复合物到宿主细胞的导管，通过该导管然后注入病毒基因组。

一些噬菌体在其TMPs中具有肽聚糖水解活性以降解细菌包膜组件。HFTV1的TMP中没有明显的蛋白水解域，表明该病毒可能不使用这种蛋白水解机制来克服S层。相反，尾部可能机械地穿透包膜，类似于针头。HFTV1中的基因组释放引发远端尾部区域的结构变化，包括BPH分离和TF解离。这些发现表明基板和TFs不仅锚定病毒，而且还促进或启动基因组弹出。

据研究人员所知，先前尚未报道古菌病毒具有预测的碳水化合物降解域的结构蛋白质。然而，碳水化合物结合和/或水解蛋白质已被鉴定为噬菌体的组件。这些蛋白质中的几种涉及细菌肽聚糖层的水解；在大多数情况下，这些碳水化合物结合/水解蛋白质形成尾刺、基板或是TFs的一部分。感染Salmonella typhimurium的P22 podophage在头部结构中插入了一个肽聚糖/胞壁质水解酶（gp4），可降解肽聚糖。此外，在myophage T4的衣壳头部中也发现了聚糖结合域，这些域参与将T4粘附到人类肠道的黏液层，以增加遇到易感Escherichia coli宿主的机会。

因此，多步吸附过程在噬菌体中很常见（即噬菌体λ、T5和SPP1）。通常，与细胞包膜糖类的结合是第一个可逆步骤，维持并暂时定向噬菌体，然后在第二步发生特定受体识别。在HFTV1中，THP中的碳水化合物结合域可能作为病毒到细胞表面的第一个锚定点。这个可逆结合步骤增加了成功不可逆结合（通过基板和TFs）发生的机会，然后触发DNA弹出从而感染。由于在其他古菌病毒基因组中没有发现THP的同源物，所描述的策略可能特定于HFTV1。

衣壳内dsDNA的盘绕让人想起在其他真核和细菌dsDNA病毒中显示的情况。这种构象的普遍性可能是由于这种构象在静电上有利，并且在极高压下注入宿主细胞时防止缠结。然而，盘绕的轴与门户不对齐，与其他有尾dsDNA病毒（如Epsilon15、T7和HSV）相比显得独特。虽然HSV确实显示倾斜盘绕（至少在