基于纳米孔测序与NGS panel的脑脊液ctDNA分析：推动CNS肿瘤微创分类新纪元

本刊推荐：为解决中枢神经系统（CNS）肿瘤传统诊断侵入性强、周期长的难题，研究人员开展基于脑脊液液体活检（LB）的纳米孔测序（ONT）与Panel NGS技术的对比研究。结果表明ONT可将检测周期从21.3天缩短至4.2天，在胶质母细胞瘤（GBM）和中枢神经系统淋巴瘤（CNSL）中实现高精度分子分型，为时间敏感性临床决策提供新方案。

　　

在神经肿瘤学临床实践中，中枢神经系统（CNS）肿瘤的精准诊断始终面临重大挑战。传统组织活检需要实施侵入性手术，对患者创伤大且风险高，尤其对于位于脑干、丘脑等深部结构的肿瘤，手术取样更是难上加难。即便获得组织样本，从手术到出具完整的分子病理报告往往需要数周时间，而病情迅猛发展的患者往往等不起这么长的周期。因此，开发一种快速、微创且能提供全面分子信息的诊断工具，已成为临床的迫切需求。

近年来，液体活检（Liquid Biopsy, LB）技术的兴起为这一难题提供了解决思路。通过检测血液或脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）中的循环肿瘤DNA（ctDNA），理论上可以实现对肿瘤的基因分型，从而避免有创手术。然而，CSF中ctDNA含量极低，对检测技术的灵敏度提出了极高要求。目前，基于杂交捕获的靶向下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）是主流方法，但其操作流程复杂、耗时漫长，限制了其在时间敏感场景下的应用。牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies, ONT）测序作为一种新兴的长读长、实时测序技术，以其快速、便携的优势在病原体检测、基因组组装等领域大放异彩，但其在CSF液体活检中的应用潜力，尤其是与成熟NGS方法的系统性对比，尚缺乏深入研究。

为了回答“ONT测序能否成为CNS肿瘤CSF液体活检的快速、可靠解决方案”这一核心问题，由德国海德堡大学医院的S. Schulz等研究人员开展了一项开创性的对比研究，其成果发表在《Neuro-Oncology》上。

研究者为开展本研究，招募了60例疑似CNS肿瘤患者，收集其CSF样本并提取细胞游离DNA（cfDNA）。对每份样本的等分试样，同步进行了Panel-based NGS（检测单核苷酸变异SNV、插入缺失Indel和拷贝数变异CNV）和ONT测序（同时分析CNV和全基因组DNA甲基化谱）。研究的关键技术方法包括：基于CSF的液体活检采样、双平台（NGS与ONT）平行测序、生物信息学分析（CNV、突变和甲基化调用）以及由多学科液体活检专家委员会对结果进行临床解读。研究队列涵盖了胶质母细胞瘤（GBM）、中枢神经系统淋巴瘤（CNSL）、星形细胞瘤（A）、室管膜瘤（EPN）、弥漫中线胶质瘤（DMG）等多种CNS肿瘤类型，其中91.7%的病例有匹配的肿瘤组织可用于验证。

研究结果

一、 总体检测性能与诊断能力

研究显示，NGS在83.3%（50/60）的样本中检测到ctDNA（即ctDNA阳性）。在这些阳性样本中，多学科专家委员会判定72.0%（36/50）能提供完整的分子诊断（A-diagnosis），28.0%（14/50）能提供部分分子诊断（B-diagnosis）。相比之下，ONT测序在81.7%（49/60）的样本中能产生可解读的数据。其中，高达60.0%（36/60）的样本能成功进行基于DNA甲基化谱的分类，这是ONT最具特色的优势；另有21.7%（13/60）的样本虽无法生成甲基化数据，但仍能提供基于CNV的分析结果。

二、 测序模式与cfDNA输入量的影响

本研究深入探讨了不同测序模式对结果的影响。当cfDNA起始量非常有限时，采用单plex（即单个样本单独上机）的ONT测序成功率极高，达到90.0%（9/10）。而在多plex（即多个样本混合上机）模式下，总体有效甲基化图谱的生成率下降至52.0%（26/50）。进一步分析发现，成功率高度依赖于总cfDNA的输入量：当输入量大于2纳克（ng）时，成功率为64.3%（18/28）；而当输入量低于2 ng时，成功率骤降至36.4%（8/22）。这一发现明确指出，在临床应用中，对于预期cfDNA含量极低的样本，应优先选择单plex的ONT检测模式以确保成功率。

三、 turnaround time (TAT) 的巨大优势

本研究最引人瞩目的发现之一是ONT在检测速度上的压倒性优势。NGS流程的中位周转时间（Turnaround Time, TAT）为21.3天，这与常规临床分子病理检测的周期相符。而ONT测序的中位TAT仅为4.2天，将检测时间缩短了整整17天。这种速度上的飞跃，使得基于CSF的分子分型结果能够及时反馈给临床医生，从而直接影响患者的治疗决策，尤其在GBM、CNSL等进展迅速、治疗时间窗短的肿瘤中具有无可估量的价值。

四、 与NGS的分类差异与互补性

在大多数情况下，两种技术的分类结果一致。然而，在20.0%（12/60）的病例中，ONT的结果修正或完善了基于NGS的分类。这些修正主要集中于两类情况：一是中枢神经系统淋巴瘤（CNSL）（n=10），ONT可能通过其卓越的甲基化分型能力提供了更精确的诊断；二是缺乏典型7/10号染色体合并缺失（7/10 signature）特征的GBM病例（n=2），ONT的甲基化分类可能提供了额外的诊断依据。同时，研究也客观指出了ONT技术的当前局限性：在3例弥漫中线胶质瘤（DMG）中，NGS因其能够准确检测出H3F3A基因的特异性驱动突变（如K27M），其诊断性能优于ONT。这表明，对于某些由特定基因突变定义的肿瘤类型，靶向NGS仍是不可或缺的补充。

结论与讨论

该研究得出结论：牛津纳米孔技术（ONT）能够实现快速、且具有临床意义的脑脊液（CSF）液体活检，从而对中枢神经系统（CNS）肿瘤，特别是胶质母细胞瘤（GBM）和中枢神经系统淋巴瘤（CNSL）进行高精度分类。这种区分具有极高的临床和治疗相关性，并解决了神经肿瘤学实践中的常见诊断难题。

尽管在低输入量的多重测序样本中性能有所下降，但ONT无与伦比的速度和显著的诊断影响力强烈支持其在时间敏感性临床工作流程中的应用。对于cfDNA输入量有限的临床液体活检研究，单plex（单样本）ONT测序是首选方案。

这项研究的意义深远。它首次在较大规模的前瞻性队列中系统比较了ONT与金标准NGS在CNS肿瘤CSF液体活检中的表现，不仅验证了ONT的临床可行性，更重要的是揭示了其独特的应用场景和价值。ONT将分子诊断周期从“周”缩短至“天”，这革命性地提升了诊断效率，使医生能在最佳时间窗内为患者制定或调整治疗方案（如针对GBM的靶向治疗或针对CNSL的特定化疗方案），最终有望改善患者预后。其同时检测遗传变异（CNV）和表观遗传特征（甲基化）的能力，提供了更全面的肿瘤分子图谱，有时甚至能纠正或补充NGS的发现。

当然，研究也启示了未来的发展方向：例如，如何优化ONT的湿实验流程（如建库方法）和生物信息学算法以提高其在低cfDNA样本中的甲基化检测成功率；如何将ONT与靶向Panel测序（用于检测如H3F3A等特定驱动突变）相结合，形成优势互补的综合性检测方案。总而言之，这项研究标志着CNS肿瘤的诊断范式正在向更快速、更微创、更全面的新时代迈进。