miR-495-3p通过靶向ZWINT抑制p38 MAPK信号通路激活从而阻断乳腺癌肺转移

为解决乳腺癌转移导致的高死亡率问题，研究人员开展ZWINT在乳腺癌转移中作用及调控机制研究，发现miR-495-3p直接靶向ZWINT并通过抑制p38 MAPK通路激活抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭和肺转移，为乳腺癌治疗提供新靶点。

　　

乳腺癌作为全球女性中最常见的恶性肿瘤，尽管在早期诊断和综合治疗方面取得了显著进展，但仍然是威胁女性健康的主要疾病。尤其令人担忧的是，约50%的患者最终会发生转移性病变，导致5年生存率急剧下降至26%。其中，肺转移占乳腺癌相关死亡的60-70%，这些转移灶通常在晚期才出现临床症状，且多在诊断后5年内发生。这些严峻的统计数据凸显了迫切需要揭示转移的新分子驱动因素并确定可行的治疗靶点。

Zeste White 10 interactor（ZWINT）作为一个重要的动粒组件，通过调节着丝粒-微管相互作用来确保基因组稳定性。大量研究表明，ZWINT在多种恶性肿瘤中作为治疗生物标志物和致癌驱动因子发挥作用。然而，目前在乳腺癌中，对ZWINT的研究主要集中在其增殖作用上，虽然研究已经确定其高表达与患者不良预后密切相关，但ZWINT在乳腺癌转移中的具体作用仍然很大程度上未知。有趣的是，先前的研究发现ZWINT表达与乳腺癌患者的远处转移免费生存期（DMFS）显著相关，提示ZWINT可能参与乳腺癌转移过程。

MicroRNAs（miRNAs）作为通过3'-UTR相互作用调节基因表达的小非编码RNA，协调包括转移在内的多种病理过程。其中，miR-495-3p在不同癌症类型中表现出环境依赖性的作用，在乳腺癌中已证明具有转移抑制活性，但其调控网络仍不完全清楚。有趣的是，生物信息学分析预测了ZWINT 3'-UTR内保守的miR-495-3p结合位点，表明可能存在直接调控关系。

这项发表在《Human Cell》上的研究系统地研究了miR-495-3p/ZWINT轴作为乳腺癌转移的新兴调节因子。通过整合体外和体内方法，研究人员定义了ZWINT在转移扩散中的功能作用，并阐明了miR-495-3p通过3'-UTR结合直接调控ZWINT的机制，表征了将该轴与肺定向性联系起来的下游信号级联。研究结果确立了miR-495-3p/ZWINT/p38 MAPK信号轴作为具有双重诊断和治疗潜力的治疗靶点，为在临床表现之前拦截转移提供了策略。

研究人员主要应用了以下关键技术方法：使用短发夹RNA（shRNA）进行基因敲低和过表达载体进行基因过表达；通过定量实时PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）分析基因和蛋白表达水平；采用伤口愈合实验和Transwell侵袭实验评估细胞迁移和侵袭能力；利用双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与靶基因的相互作用；通过慢病毒载体构建稳定敲低细胞系；建立小鼠肺转移模型并采用苏木精-伊红（HE）染色分析肺组织病理变化；运用生物信息学工具预测miRNA靶点并分析临床相关性。

ZWINT敲低抑制乳腺癌细胞体外迁移和侵袭

研究人员首先使用CancerSEA数据库评估了ZWINT与乳腺癌细胞生物学功能之间的平均相关性，结果显示ZWINT除调节增殖外，与乳腺癌细胞侵袭密切相关。随后，他们在人正常乳腺上皮细胞系（MCF-10A）和人乳腺癌细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）中分析了ZWINT表达水平，发现ZWINT在MCF-7和MDA-MB-231细胞中的mRNA和蛋白水平均显著升高。通过构建三种特异性靶向ZWINT的shRNA，研究人员发现ZWINT敲低显著抑制了MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力。

ZWINT敲低通过p38 MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭

现有证据表明p38 MAPK信号通路的激活在乳腺癌转移和侵袭中起关键作用。蛋白质印迹结果显示，ZWINT敲低显著抑制了p38 MAPK和Phospho-p38 MAPK的蛋白表达水平，并显著降低了Phospho-p38 MAPK/p38 MAPK比率，表明ZWINT敲低抑制了乳腺癌细胞中p38 MAPK信号通路的激活。通过使用p38 MAPK通路激活剂Anisomycin进行的挽救实验表明，Anisomycin能显著减弱ZWINT敲低对细胞迁移和侵袭的抑制作用。

ZWINT敲低通过抑制p38 MAPK信号通路激活减弱乳腺癌肺转移

为了进一步探索ZWINT在乳腺癌转移中的作用，研究人员通过尾静脉注射建立了裸鼠肺转移模型。结果显示，ZWINT敲低显著降低了小鼠肺转移负荷，HE染色显示ZWINT敲低显著减少了裸鼠肺组织中的转移病灶数量。蛋白质印迹分析进一步证实，ZWINT敲低在体内显著抑制了p38 MAPK信号通路的激活。

miR-495-3p直接靶向ZWINT抑制其表达

为阐明ZWINT在乳腺癌中失调的分子机制，研究人员使用多种软件预测了可能与ZWINT结合的miRNAs，发现miR-124-3p、miR-495-3p和miR-506-3p可能与ZWINT有潜在结合位点。ENCORI在线数据分析显示，只有miR-495-3p与ZWINT在乳腺癌中呈显著负相关。Kaplan-Meier绘图仪显示，只有miR-495-3p高表达与乳腺癌患者良好预后负相关。功能实验表明，miR-495-3p过表达显著抑制了乳腺癌细胞迁移和侵袭，而miR-495-3p敲低则促进了这些过程。机制研究表明，miR-495-3p过表达显著抑制了ZWINT在mRNA和蛋白水平的表达，而miR-495-3p敲低则产生相反效果。荧光素酶报告实验证实，miR-495-3p过表达显著抑制了ZWINT-WT的荧光素酶活性，但对ZWINT-Mut无影响。

miR-495-3p通过调节ZWINT介导的p38 MAPK通路抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭

为探索miR-495-3p是否通过调控ZWINT影响乳腺癌细胞迁移、侵袭和p38 MAPK通路，研究人员进行了回复实验。结果表明，转染ZWINT过表达质粒可显著逆转miR-495-3p对ZWINT表达的抑制作用。伤口愈合实验和Transwell侵袭实验显示，ZWINT过表达显著减弱了miR-495-3p过表达对细胞迁移和侵袭的抑制作用。蛋白质印迹分析表明，ZWINT过表达恢复了被miR-495-3p过表达抑制的p38 MAPK和Phospho-p38 MAPK蛋白表达水平以及Phospho-p38 MAPK/p38 MAPK比率。

研究结论和讨论部分强调了这些发现的重要意义。转移仍然是乳腺癌患者死亡的主要原因，迫切需要阐明其分子驱动因素。该研究通过证明ZWINT沉默通过抑制p38 MAPK通路抑制乳腺癌细胞体外迁移和侵袭并减弱体内肺转移，填补了这一关键知识空白。从机制上讲，研究人员确定了miR-495-3p作为ZWINT的直接转录后调节因子，建立了一个新的miR-495-3p/ZWINT/p38 MAPK轴来调控转移行为。

ZWINT的致癌功能表现出显著的组织环境依赖性。在乳腺癌中，ZWINT直接被miR-204靶向和抑制，与CDK1形成正反馈环以驱动G1/S期转变并促进增殖。然而，ZWINT在乳腺癌转移微环境中的作用和调控机制仍然不明确。该研究提供了令人信服的证据证明ZWINT参与乳腺癌侵袭和转移。一系列功能实验证明，ZWINT敲低显著抑制了乳腺癌细胞体外迁移和侵袭，并抑制了体内肺转移。

p38 MAPK信号通路在肿瘤发生和转移中至关重要，其激活在多种肿瘤类型中均有观察到。然而，p38 MAPK信号通路在乳腺癌肿瘤发生和转移中的作用仍存在争议。该研究发现ZWINT敲低降低了p38 MAPK及其磷酸化的蛋白表达水平以及Phospho-p38 MAPK/p38 MAPK比率，表明ZWINT敲低抑制了乳腺癌中p38 MAPK通路激活。此外，数据显示p38 MAPK通路激活剂Anisomycin显著逆转了ZWINT敲低对乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用，表明ZWINT沉默通过阻断p38 MAPK通路激活来抑制乳腺癌细胞侵袭和转移。

miRNA与其mRNA靶标之间的调控相互作用已成为控制肿瘤进展（包括乳腺癌转移）的关键机制。研究结果表明，乳腺癌细胞中miR-495-3p表达减少通过3'UTR结合破坏了对ZWINT的直接靶向，导致ZWINT过表达——这是转移行为的关键驱动因素。重要的是，ZWINT受到跨癌症类型的肿瘤抑制miRNA网络的共同调控。

该研究的局限性在于，虽然体外研究结果牢固确立了miR-495-3p/ZWINT/p38 MAPK轴在抑制转移相关表型中的作用，但两个关键的转化差距仍然存在。首先，尽管数据表明miR-495-3p作为ZWINT的上游调节因子，但该轴在体内的功能意义尚未确定。其次，miR-495-3p水平、ZWINT/p38 MAPK通路和转移复发之间的临床相关性尚未建立。

总之，这些数据表明ZWINT是乳腺癌侵袭和转移的潜在治疗靶点。最重要的是，研究结果表明，miR-495-3p过表达通过阻断ZWINT介导的p38 MAPK通路激活抑制了乳腺癌细胞侵袭和转移。这些结果表明miR-495-3p/ZWINT轴是抑制乳腺癌侵袭和转移的新靶点。