多模态阴离子交换膜的制备及其用于全腺相关病毒衣壳的色谱纯化研究

本研究成功开发了一种基于2-甲基苯基咪唑功能化电纺再生纤维素的多模态阴离子交换膜（MMAEX），实现了高载量条件下（≈0.5–1.3×1014颗粒/mL膜体积）全/空腺相关病毒（AAV）衣壳的高效分离。通过梯度洗脱获得72.9%回收率（85.3%纯度），两步洗脱实现70.3%回收率（92.2%纯度），且纯化后病毒转导效率未受影响，为基因治疗载体纯化提供了创新解决方案。

　　

引言

重组腺相关病毒（rAAV）因其低致病性和长效性成为基因治疗产品的优选载体。截至2024年，FDA批准的基因治疗产品已超过40种，其中AAV相关产品显著增长。然而，病毒组装过程中产生的空衣壳（无DNA内容物）与全衣壳比例可达10:1，空衣壳的存在会降低治疗效果并引发免疫反应。由于全/空衣壳尺寸相近（18–24 nm），无法通过尺寸分离，但密度（全衣壳1.40 g cm^?3 vs. 空衣壳1.32 g cm^?3）和电荷特性（全衣壳更负电、更亲水）的差异为色谱分离提供了基础。阴离子交换（AEX）色谱利用结合-洗脱操作可实现分离，但需精细优化条件。本研究开发的多模态阴离子交换膜（MMAEX）在超高载量下实现了高效分离。

材料与试剂

研究使用了Sigma-Aldrich、VWR和Thermo Fisher Scientific提供的化学试剂与细胞培养材料，包括电纺纤维素乙酸酯、单体、催化剂、缓冲液组分及AAV生产所需培养基、转染试剂和检测试剂盒。病毒滴度通过qPCR（全衣壳）和ELISA（总衣壳）定量，感染性通过HEK293细胞转导实验评估。

实验部分

3.1 电纺再生纤维素（RC）膜的制备

以丙酮/DMAC（2:1, w/w）为溶剂，制备14.2 wt%纤维素乙酸酯纺丝液，在13.5 kV电压、75%湿度下电纺9小时，经NaOH水解获得RC纳米纤维膜，平均孔径0.5 μm，孔隙率82%。

3.2 多模态AEX配体接枝

通过表面引发原子转移自由基聚合（SI-ATRP）分步功能化：

1）引发剂固定：以2-溴异丁酰溴（2-BiB）和三乙胺（TEA）在乙腈中处理膜表面3小时；

2）聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）接枝：在THF中以CuCl/PMDETA催化GMA聚合，时间0–240 min，接枝度从0%增至23%；

3）2-苯基咪唑偶联：在甲醇/水溶液中60°C反应；

4）N-甲基化：以碘甲烷/2,6-卢啶在2-丁酮中生成带正电的1-甲基苯基咪唑配体。

FTIR证实1730 cm^?1处C=O伸缩峰（PGMA特征）及700–780 cm^?1苯基/甲基吸收峰。

3.3 膜表征

SEM/AFM显示功能化前后纤维形态（直径100–400 nm）和孔隙结构（孔径250–800 nm）无显著变化，但水接触角从亲水（<30°）增至疏水（97°），表明配体疏水性增强。静态BSA结合容量达100 mg mL^?1，动态结合容量为67.6–77.5 mg mL^?1，回收率>96%。

3.4 AAV生产与纯化

HEK293悬浮细胞培养至5–6×10⁶ cells mL^?1后转染AAV2质粒，72小时后裂解细胞，经切向流微滤澄清，AAVX亲和层析捕获，再经透析换液去除甘氨酸（干扰结合）。

3.5 色谱分离

使用?KTA FPLC系统，膜堆体积0.025 mL，结合缓冲液为20 mM BTP + 2 mM MgCl₂（pH 9.0，电导率1.5 mS cm^?1）。

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  梯度洗脱：电导率从1.5升至15 mS cm^?1，载量5.56×10¹³ vc mL^?1；
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  两步洗脱：第一段电导率8.0/8.5/9.0 mS cm^?1，第二段14 mS cm^?1，载量1.32×10¹⁴ vc mL^?1。

3.6 分析检测

qPCR定量全衣壳，ELISA测总衣壳，空衣壳由差值计算。Zeta电位测定显示空衣壳等电点（pI=5.8）高于全衣壳（pI=5.3），证实电荷差异。感染实验以MOI≈4×10⁴感染HEK细胞，48小时后计数荧光细胞。

结果与讨论

4.1 梯度洗脱分离

在载量5.56×10¹³ vc mL^?1下，梯度洗脱出现双峰（电导率6.3和10.1 mS cm^?1），A₂₆₀/A₂₈₀比值分别为0.81（空衣壳）和1.16（全衣壳）。收集馏分显示：

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  馏分4–11：全衣壳回收率82.7%，纯度67.2%；
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  馏分6–11：回收率72.9%，纯度85.3%；
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  馏分7–11：回收率59.6%，纯度92.0%。

4.2 两步洗脱优化

载量提升至1.32×10¹⁴ vc mL^?1时：

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  第一段电导率9.0 mS cm^?1：全衣壳回收率70.3%，纯度92.2%；
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  电导率8.5 mS cm^?1：回收率76.0%，纯度77.9%；
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  电导率8.0 mS cm^?1：回收率87.9%，纯度59.2%。
  结果表明通过调节电导率可权衡回收率与纯度。

4.3 感染性验证

纯化前后AAV2的MOI均为≈4×10⁴，感染效率（39.9% vs. 27.9%）差异源于病毒数量而非活性损失，证实MMAEX过程未损害病毒完整性。

结论

本研究开发的MMAEX膜具备高孔隙率和协同电荷/疏水作用，在远超文献载量（高达1.3×10¹⁴ vc mL^?1）下实现了全/空AAV2的高效分离，两步洗脱可获得>92%纯度且保持病毒感染性，为基因治疗产业提供了可放规模、低成本的纯化平台。