剪接体回收因子SART3通过二聚化及RNA识别基序（RRM）不对称识别U6 snRNA的结构机制研究

本综述系统解析了人源剪接体回收因子SART3通过二聚化形式，利用其C端两个RNA识别基序（RRM）以非经典模式特异性识别U6小核RNA（snRNA）不对称凸起区域的分子机制。研究通过多种生物物理学手段（NMR、ITC、MALS等）揭示SART3与酵母同源蛋白Prp24在RNA结合机制上的进化分歧，为理解真核生物pre-mRNA剪接（splicing）的分子基础提供了新视角。

　　

Abstract

人源剪接体相关因子SART3作为剪接体回收过程中的关键因子，通过与U6小核RNA（snRNA）结合促进U4/U6小核核糖核蛋白复合物（snRNP）的形成。不同于酵母Saccharomyces cerevisiae中利用四个RNA识别基序（RRMs）与U6 snRNA相互作用的同源蛋白Prp24，SART3在其C末端仅含有两个RRM结构域。本研究证明SART3以二聚体形式结合U6 snRNA，四个RRM亚基通过保守的阳离子表面识别U6 snRNA的不对称凸起区域。研究发现SART3的RRM结构域采用典型的βαββαβ折叠模式，并通过特异性识别U6凸起区域中与酵母Prp24不同的序列元件，揭示了剪接体组装和回收过程中U6 snRNA识别的 divergent RRM结合机制。

Abbreviations

研究涉及的主要缩写包括：化学位移扰动（CSP）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、半四肽重复序列（HAT）、异核单量子相干谱（HSQC）、内部茎环（ISL）、多角度光散射（MALS）、核磁共振（NMR）、核奥弗豪泽效应光谱（NOESY）、前体信使RNA（pre-mRNA）、均方根偏差（RMSD）、RNA识别基序（RRM）、鳞状细胞癌抗原识别T细胞3（SART3）、小核RNA（snRNA）、小核核糖核蛋白（snRNP）以及总相关光谱（TOCSY）。

Introduction

RNA剪接是真核生物中将前体信使RNA（pre-mRNA）转化为成熟mRNA的过程，通过移除内含子并连接相邻外显子完成。这一过程由剪接体介导，该大分子复合体由五种小核核糖核蛋白（snRNPs；U1、U2、U4、U5和U6）及相关蛋白组成。剪接体形成涉及U1和U2 snRNPs对pre-mRNA内含子的初始识别，随后招募预组装的U4、U5和U6 snRNP复合体进行催化剪接。该过程的失调可能导致与非功能蛋白产生相关的多种人类疾病，凸显了有序剪接体组装和功能的重要性。

SART3（鳞状细胞癌抗原识别T细胞3）作为酵母Prp24的哺乳动物同源物，与U6 snRNA结合并促进U4/U6复合体的形成。人源SART3在细胞核中检测到存在于二元U4/U6 snRNP复合体中，但未见于三元U4/U6·U5 snRNP复合体或剪接体组装中。因此，推测SART3通过招募U4和U6 snRNPs参与snRNP组装的早期阶段。人源SART3与酵母Prp24共享同源的RNA识别基序（RRMs），但具有不同的域组织：SART3包含12个半四肽重复（HAT）、核定位序列（NLS）、两个RRMs和一个LSm结合域；而Prp24包含四个RRMs和一个C端LSm结合域。

在Prp24-U6 snRNA复合体中，Prp24的四个RRMs与U6 snRNA的不对称凸起区域紧密结合。人源SART3可能以类似方式与U6 snRNA相互作用，但其仅有的两个RRMs如何识别U6 snRNA尚不清楚。本研究报道两个SART3的RRM1结构域同时结合U6 snRNA，使得二聚体SART3能够利用四个RRMs进行U6 snRNA结合。SART3 RRM1特异性结合U6 snRNA凸起区域，RRM2则增强结合亲和力。值得注意的是，SART3结合的U6序列与Prp24不同，表明剪接中RNA识别的 divergent 进化。

Results

Design of U6 snRNA and SART3 domain constructs

研究设计了人源U6 snRNA和SART3的域构建体。基于酵母U6 snRNA的晶体结构（PDB代码4N0T），采用了包含端茎（telestem）、不对称凸起和内部茎环（ISL）区域的人源U6 snRNA模型。为增强U6_FL（核苷酸24-95）的稳定性，对端茎区域的核苷酸进行了工程化以形成Watson-Crick碱基对。为荧光测量，制备了FAM标记的茎区域缩减但保留结合接口的截短U6 snRNA（U6_TR；核苷酸30-58和77-89）。此外，还制备了涵盖核苷酸33-54的U6 snRNA（U6_33–54）以评估凸起区域在SART3结合中的功能。

人源SART3（残基1-963）包含N端HAT重复，随后是C端的两个RRM域。为研究单个RRM域在U6 snRNA结合中的功能，制备了SART3的RRM域（RRM_1–2）以及单独的RRM1和RRM2构建体。为研究SART3的HAT介导二聚化对U6 snRNA相互作用的影响，还制备了与RRM_1–2连接的N端HAT重复域（HAT-RRM）。

Two SART3 RRMs bind U6 snRNA at the asymmetric bulge region

通过荧光偏振分析（FPA）测量了SART3 RRM与U6 snRNA的结合亲和力。RRM_1–2与荧光素标记的U6_TR结合的平衡解离常数（K_D）为153 ± 10 nM。RRM_1–2与U6_33–54的结合亲和力略低（K_D = 188 ± 5 nM），表明U6 snRNA的不对称凸起是SART3 RRM_1–2的主要识别位点。单独的RRM1与U6_33–54结合的K_D为1020 ± 160 nM，比RRM_1–2弱五倍，且结合略微偏离Langmuir吸附等温线，表明可能存在非 identical 结合位点。RRM2单独与U6_33–54的结合显著降低，K_D估计 >50 μM。这些结果证明SART3 RRM_1–2识别U6 snRNA的不对称凸起，其中RRM1在结合亲和力中起主导作用。

电泳迁移率变动分析（EMSA）显示，随着RRM_1–2的形成，U6_FL条带以逐步方式迁移，表明RRM_1–2在U6_FL上有两个结合位点。U6_33–54也观察到类似的条带迁移，表明U6_33–54凸起区域能够结合两个RRM_1–2分子。通过多角度光散射（MALS）联用尺寸排阻色谱（SEC）测定RRM_1–2（计算质量23.4 kDa）与U6_FL（计算质量23.3 kDa）复合物的分子量为62 ± 7 kDa，符合2:1化计量比。类似地，RRM_1–2与U6_33–54（计算质量7.2 kDa）复合物的分子量为52 ± 5 kDa，进一步支持两个RRM_1–2与一个U6_33–54的复合。单独的RRM1也引起U6_33–54的条带迁移，而RRM2由于低亲和力未显示明显条带迁移。等温滴定量热法（ITC）分析显示RRM1与U6_33–54结合为2:1化计量，K_D为940 ± 160 nM，而RRM2显示可忽略的结合热，与FPA结果一致。

晶体结构分析和细胞实验表明，分离的SART3 HAT域形成功能二聚体。MALS分析显示HAT-RRM（计算质量90.9 kDa）作为单一峰洗脱，绝对分子量为183 ± 1 kDa，表明在溶液中为稳定二聚态。值得注意的是，二聚体HAT-RRM与U6_FL形成1:1复合物，分子量为208 ± 2 kDa，支持两个RRM_1–2与U6_FL的结合。

Identification of U6 snRNA elements for SART3 RRM binding

通过分析¹³C标记的U6_33–54在滴定SART3 RRM_1–2时的2-D ¹H-¹³C HSQC谱，研究了U6_33–54共振的线宽变化。滴定导致U6_33–54共振逐渐 broadening 和消失，表明在化学位移时间尺度上处于 intermediate exchange。通过2-D ¹H-¹H NOESY基于核苷酸碱基和核糖H1'质子之间的连续性完全 assigned 了U6_33–54的C₆H₆/C₈H₈核苷酸碱基共振。计算了滴定SART3 RRM_1–2时U6_33–54共振的归一化强度比，显示Cyt37、Ade39和Cyt42的线宽增加最大，Ade45、Ade47和Ade50的强度也显著下降，而Ura40、Gua44和Gua46以及末端核苷酸（Gua33–Gua34和Ura51–Gua54）的线宽增加最小。总体而言，强度下降较大的核苷酸位于Ade35至Ade50之间，表明U6_35–50区域包含RRM_1–2结合位点。

滴定单个RRM1和RRM2也引起U6_33–54共振的线宽变化，但程度低于RRM_1–2滴定。RRM1滴定导致U6_35–50区域强度下降较大，与RRM_1–2类似，而RRM2滴定显示较弱的线宽变化 profile。线宽变化程度与U6_33–54与RRM_1–2、RRM1和RRM2的结合亲和力相关，但线宽变化 profile 不足以识别RRM结合的U6元件。因此，通过逐步截短U6_33–54并使用ITC测量结合亲和力，搜索了RRM结合必需的U6元件。

trimming U6_33–54的5'和3'端核苷酸显示，U6_38–50保持了与U6_33–54观察到的结合亲和力和2:1化计量比。进一步截短U6_38–50的任一端改变了结合化计量，U6_38–49仅容纳一个RRM1， pinpointing 13核苷酸U6_38–50作为容纳两个RRM1s的最小序列。从U6_38–50的3'端截短显示，U6_38–44保持与单个RRM1相当