综述：花青素在食物和分离来源中的抗肿瘤、抗炎和抗氧化活性：方法学见解及其与肠道微生物群的相互作用

本综述系统阐述了花青素在抗氧化、抗炎及抗肿瘤方面的多重生物活性，重点探讨了其通过清除自由基（如DPPH、ABTS）、调节炎症因子（如TNF-α、IL-6、NF-κB）及干预关键信号通路（如PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT）发挥作用的机制。同时深入分析了花青素与肠道菌群的互作，及其代谢产物短链脂肪酸（SCFAs）对健康的增益效应，为开发基于花青素的营养干预策略提供了重要理论依据。

　　

2. 来源、生物合成与化学结构

花青素广泛存在于草莓、蔓越莓、黑莓、蓝莓、石榴、红萝卜、葡萄、巴西莓、紫黑色谷物（如紫玉米、紫小麦和紫米）以及一些饲草如高粱（Sorghum bicolor）和紫象草（Cenchrus purpureus）中。它们是植物中的水溶性色素，呈现红、紫、橙、蓝、紫等多种颜色，分布于果实、叶片、茎和根等不同部位，其含量因来源而异。

花青素的生物合成始于苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化下转化为对香豆酸，随后经过查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和花青素合成酶（ANS）等一系列酶促反应，最终在植物液泡中合成。

其基本结构为花色素阳离子（flavylium cation），具有多个羟基和甲氧基取代，通常连接在C3、C4、C5、C6和C7位。花青素是花色素（anthocyanidins）的糖苷形式，糖基化（如葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖）常发生在C-3位，可增强色素稳定性。此外，还存在甲基化和酰化（如与香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等芳香酸或丙二酸、乙酸等脂肪酸酯化）形式，这些修饰也显著提高了花青素的稳定性。这种独特的分子结构及其pH依赖性变色特性是其抗氧化性和多彩颜色的基础。

常见的花青素类型包括：天竺葵素（pelargonidin，亮红色）、矢车菊素（cyanidin，红至红紫色）及其甲基化衍生物、飞燕草素（delphinidin）及其甲基化衍生物锦葵素（malvidin）和矮牵牛素（petunidin，蓝至紫色）。

3. 生物利用度与肠道微生物群

花青素的临床应用面临其低系统生物利用度的挑战。生物利用度涉及生物可及性（在胃肠道恶劣条件下的存留能力）和生物效应。其吸收受化合物结构、食物基质相互作用、微生物群及个体生理和遗传特征等多种因素影响。

在胃部酸性环境（pH 1.5–2.0）中，花青素以稳定的黄烊阳离子形式存在。进入小肠后，在中性pH（6.5–7.5）下转化为查尔酮、醌式碱和 carbinol pseudobases等形式，吸收率在人体临床试验中约为5–10%。结肠是花青素代谢的主要场所，未被吸收的花青素在此经肠道微生物群广泛代谢，生成多种具有生物活性的酚酸和短链脂肪酸（SCFAs）。

人类研究表明，摄入剂量的很大一部分（有时超过80%）以未被吸收的形式到达结肠。结构特征如缀合糖的类型和甲基化程度影响这一过程。微生物转化产生结构依赖的代谢物谱：矢车菊素衍生物主要产生原儿茶酸、香草酸和对香豆酸；锦葵素衍生物产生丁香酸和高香草酸；天竺葵素-3-葡萄糖苷衍生物产生酪醇和对羟基苯甲酸。

花青素对肠道微生物群的组成和功能具有调节作用。体外研究表明，黑米中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷可在24小时内选择性促进有益菌（如青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌）生长，同时减少病原体（如产气荚膜梭菌和大肠杆菌）。紫甘薯中的芍药素可抑制金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。人类粪便培养和饮用红酒的研究也观察到类似的有益菌增加和潜在致病菌减少的趋势。

动物研究表明其作用具有剂量依赖性，并能显著改变菌群比例（如厚壁菌门/拟杆菌门比例）。人体反应则更具变异性，受年龄和基线微生物群状况的影响。

微生物发酵花青素产生的SCFAs（如丁酸盐）在肠道和全身稳态中发挥多方面的作用：为结肠细胞供能、通过紧密连接蛋白（occludin, claudins）增强肠道屏障、刺激杯状细胞分泌黏液、作为免疫调节剂抑制组蛋白去乙酰化酶（HDACs）和激活G蛋白偶联受体43/109A（GPR43/GPR109A）、促进调节性T细胞分化和抑制促炎通路。由此产生的管腔酸化（pH ～5.5–6.5）抑制致病性肠杆菌科，同时有利于产丁酸盐的共生菌。

4. 生物学特性

花青素因其多样的生物效应而被广泛研究，其突出的特性包括有效的抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性。

4.1. 抗氧化

慢性疾病过程的主要起始机制涉及氧化应激，即活性氧（ROS）的产生与机体中和或修复它们的能力之间的失衡。花青素通过中和自由基来防止细胞损伤。其具体作用机制包括：I) 氢原子转移（HAT），通过提供氢原子稳定自由基；II) 向自由基提供电子；III) 螯合金属离子，形成稳定键；IV) 激活超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶。

此外，花青素还能通过调节与氧化应激和炎症相关的细胞信号通路来发挥抗氧化功能，例如调节参与抗氧化和抗炎反应的基因表达。花青素B环上的羟基和糖残基的酚酸芳基化赋予了其中和自由基的强大潜力。C环上的羟基使其能够螯合金属离子，抑制自由基攻击细胞膜脂质引起的脂质过氧化。

4.2. 抗炎

在炎症过程中，免疫系统通过协调反应来应对有害刺激。花青素作为替代化合物，可调节与炎症反应相关的细胞信号通路。研究将其与抑制促炎细胞因子、减少细胞粘附分子表达和抑制炎症细胞（如巨噬细胞）活化联系起来。

巨噬细胞是体外分析抗炎反应的常用模型，其活化通常涉及脂多糖（LPS）和/或干扰素-γ（IFN-γ）信号传导。巨噬细胞产生一氧化氮（NO）、ROS和蛋白水解酶以清除微生物。诱导型一氧化氮合酶（iNOS或NOS2）负责NO的产生，并受肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎细胞因子的调节。在氧化应激增加的情况下，NO可与超氧阴离子（O₂^?）反应形成过氧亚硝酸盐（ONOO^?），这是一种高反应性分子，可导致DNA损伤，促进炎症和组织损伤。

核因子κB（NF-κB）是炎症反应的关键调节因子。在静息状态下，NF-κB与抑制蛋白（IκB）结合存在于细胞质中。炎症刺激激活IκB激酶复合物（IKK），磷酸化IκB并释放NF-κB，使其易位到细胞核中，作为转录因子结合DNA，促进促炎基因表达。

花青素的抗炎特性已在体外研究和动物模型中得到广泛证实。研究表明，花青素可以调节多种炎症通路，包括抑制TNF-α和白细胞介素等促炎细胞因子的产生，降低细胞粘附分子和促炎酶（如环氧合酶-2 (COX-2) 和iNOS）的表达。它们还与细胞内信号通路（如NF-κB和MAP激酶）的调节有关。

人体研究也证明了花青素的抗炎作用。例如，富含花青素的来源（如红苹果和黑果腺肋花楸）对高胆固醇血症患者的炎症生物标志物显示出影响。补充花青素（320 mg/天）可显著降低非炎症性脂肪肝病（NAFLD）患者血浆中促炎细胞因子IL-1β、IL-18和IL-6的水平，并下调外周血单核细胞（PBMCs）中caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA表达。

4.3. 抗肿瘤活性

癌症以体内细胞的异常生长和发育为特征。花青素在预防和治疗非传染性疾病（NCDs）（如癌症）方面显示出潜力。

4.3.1. PI3K/AKT/mTOR

临床研究探讨了富含花青素的水果和蔬菜摄入与降低癌症风险（尤其是结直肠癌和乳腺癌）之间的关系。在三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中，花青素可调节多个癌症相关过程，包括通过增加cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）诱导凋亡，以及通过下调蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素机制靶标（mTOR）通路抑制细胞增殖和影响血管生成。

类似地，从黑豆皮中分离的花青素在肺腺癌（A549）、小鼠胶质瘤（GL261）和大鼠胶质瘤（C6）细胞中显示出强大的细胞活力抑制作用。特别是飞燕草素，通过阻断细胞外信号调节激酶（ERK）和磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素机制靶标（mTOR）/70-kDa核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）信号通路，抑制缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达，从而发挥抗血管生成作用。

4.3.2. 人体研究

一项随机双盲临床试验对35名腺瘤性息肉患者进行了研究，其中一组接受安慰剂，其他组接受姜黄素和 associated 花青素（各1克）治疗六周。评估了与结直肠癌进展相关的炎症和代谢生物标志物，如脂联素、血糖和体重指数（BMI）。虽然研究使用了两种化合物的组合，但观察到与结直肠癌风险相关的代谢生物标志物有改善趋势，表明花青素可能在其中发挥作用。

4.3.3. FAK通路与侵袭

另一项涉及35名健康个体的随机双盲临床试验评估了饮用富含花青素的果汁的效果。摄入果汁后，研究人员分析了参与者血浆中存在的花青素代谢物，并将其用于体外研究，特别是对胰腺癌细胞（如PANC-1细胞）的影响。探索性代谢组学分析发现，o-香豆酸和芍药素-3-半乳糖苷与PANC-1细胞迁移呈负相关，这种效应归因于核因子κB（NF-κB）和局部粘着斑激酶（FAK）的磷酸化减少。

4.3.4. 体外细胞毒性

遵循体外模型，一项类似的研究使用含有约35.8%矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）的3克生黑豆粉提取物处理人肝癌细胞系（HepG2）。酰化花青素以剂量依赖性方式显著抑制HepG2细胞，并且对正常肝细胞毒性较低，显示出抑制癌细胞生长而不影响健康细胞的潜在选择性。

另一项研究中，富含花青素的石榴（Punica granatum L.）提取物被包裹在鞘脂体中，浓度范围从31.25到1000 μg/mL，并分析了其对三种细胞系的细胞毒性作用：乳腺癌（MCF-7）、宫颈癌（HeLa）和结直肠癌（HCT116）。在所有测试的细胞系中观察到剂量依赖性的细胞生长抑制，当浓度达到1000 μg/mL时，对细胞系的抑制超过90%。

总的来说，不同的花青素已证明能够抑制异常细胞生长、诱导凋亡以及抑制体外和体内模型中的侵袭和转移，并有一些初步的人体证据。其作用机制包括：1) 干扰多种细胞信号通路，如激活AMP活化蛋白激酶（AMPK）通路；2) 调节PI3K/AKT/mTOR通路；3) 抑制STAT和STAT3，从而抑制JAK-STAT通路。此外，由于花青素的抗炎和抗氧化作用，它们在通过预防细胞DNA损伤来预防癌症等疾病方面具有巨大潜力。

5. 用于筛选花青素生物效应的研究方法

5.1. 抗氧化效应

分析体外抗氧化活性的常用方法有DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、FRAP（铁离子还原抗氧化能力）和ABTS[2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]。这些测定通常涉及使用分光光度计测量吸光度。

DPPH法基于稳定的紫色自由基DPPH·被抗氧化剂还原为无色的二苯基三硝基苯肼（DPPH-H），通过测量515–520 nm处吸光度的降低来评估自由基清除能力。FRAP法测量样品将Fe³⁺-TPTZ复合物还原为Fe²⁺形式的能力，在593 nm处测量生成的蓝色复合物的吸光度。ABTS法则基于抗氧化物质与ABTS^+·阳离子自由基的反应，使其褪色，并在734 nm处测量吸光度的下降。

由于每种方法的化学机制不同，其结果不能直接比较。通常需要结合使用多种方法来全面分析化合物的抗氧化活性。

5.2. 抗炎效应

评估抗炎活性的方法包括检测iNOS（负责NO合成）等酶的产生和细胞因子水平。Western blotting和酶联免疫吸附测定（ELISA）是研究炎症通路调节的常用技术。

Western blotting用于检测特定蛋白质的表达和翻译后修饰（如磷酸化），如NF-κB、IκB和MAPK信号分子。ELISA是一种高度敏感和特异的免疫测定法，用于定量生物样品中的各种分析物，如细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和趋化因子（MCP-1）。

5.3. 抗肿瘤效应

体外分析花青素抗肿瘤活性的方法多种多样。细胞活力测定，如MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）法和MTS法，通过评估细胞代谢活性作为细胞活力的间接标志。MTT法基于活细胞将黄色MTT还原为不溶性的紫色甲臜。Alamar Blue法则基于呼吸链酶将刃天青还原为试卤灵，产生荧光或颜色变化。

细胞凋亡检测，包括膜联蛋白V/碘化丙啶（PI）染色结合流式细胞术，以及caspase-3和caspase-9活化检测，用于区分凋亡细胞和坏死细胞。分子技术如定量聚合酶链反应（qPCR）、Western blotting和ELISA常用于研究与凋亡、细胞周期调控和炎症反应相关的基因和蛋白质表达变化。

此外，细胞内ROS测定用于评估细胞的氧化应激状态。集落形成测定用于确定花青素处理的长期抗增殖效果。伤口愈合测定（划痕实验）和细胞迁移测定（如Transwell实验）用于评估癌细胞的转移潜力。磺酰罗丹明B（SRB）测定是一种比色法，通过量化细胞的总蛋白含量来可靠地评估长期细胞增殖和细胞毒性。

这些互补的方法共同提供了对花青素抗肿瘤特性的全面评估，并有助于阐明其治疗潜力和作用机制。

6. 工业应用的挑战

花青素虽展现出良好的生物活性，但其工业应用仍受限于化学不稳定性、低生物利用度以及在降解过程中可能产生不良风味和气味。此外，传统提取技术通常产率低、过程漫长且成本高，而先进方法虽然更高效，但可能进一步增加成本。

超声波辅助提取（UAE）和微波辅助提取（MAE）等策略因其快速、选择性高、溶剂消耗少和更好地保留功能特性而脱颖而出。超临界CO₂萃取（SFE-CO₂）和加压流体萃取（PFE）等更先进的技术结合了快速性、选择性和使用环保溶剂的优点，提供比传统方法更高的产率。

纳米封装已成为克服不稳定性和低生物利用度相关限制的有前途的工具。它提供针对光、氧气、pH、温度和湿度的保护，同时实现花青素的控释和靶向释放。各种纳米载体已被探索，包括蛋白质（酪蛋白、铁蛋白纳米笼、WPI、白蛋白）、多糖（果胶、壳聚糖、β-环糊精）、脂质（脂质体、类脂质体、胶束）和外泌体。这些结构增强了化学和热稳定性，促进了更有效的吸收和组织分布，延长了胃肠道半衰期，并在某些情况下增强了生物效应。

7. 结论、局限性与未来展望

总之，花青素是在各种水果、蔬菜、花卉和植物种子中发现的次级代谢产物，以其抗氧化、抗炎和抗肿瘤特性而闻名。这些化合物在缓解氧化应激、调节炎症通路和抑制肿瘤生长方面发挥着至关重要的作用。

尽管有这些有益效果，花青素的更广泛应用仍面临几个挑战。主要障碍之一是其化学稳定性低，易受高温、碱性pH、氧气、光和酶活性等因素影响而降解。其生物利用度有限，在胃部酸性环境中会降解，在小肠中的吸收受限。提取过程往往效率低下，不恰当的提取技术会加速降解。此外，许多花青素的主要天然来源（如浆果）也是人类饮食的重要组成部分，这限制了其用于工业提取，导致生产成本更高和市场竞争加剧。

为了解决花青素生物利用度低的问题，各种技术策略正在开发中，包括控释系统、纳米颗粒和封装方法（如使用脂质体或生物聚合物）。这些系统在结构组成、释放动力学和改善稳定性与递送的具体机制上有所不同。此外，正在探索将花青素与其他生物活性化合物结合或设计协同配方以优化其功能潜力。

了解花青素的精确作用机制仍然是一个关键的研究领域。持续的研究对于充分阐明其抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用至关重要，从而为开发创新的治疗策略铺平道路。未来的研究应侧重于确定最佳剂量、给药途径和目标人群，以最大化花青素在预防和辅助对抗非传染性疾病方面的作用。探索紫象草等替代来源可能为大规模花青素生产提供更可持续和更具成本效益的选择。