综述：球状幽门螺杆菌：再感染的关键驱动因素与新疗法的靶点

本综述深入探讨了幽门螺杆菌（H. pylori）在应激下转变为球状（coccoid）形态的生物学意义，强调其作为可存活但不可培养（VBNC）状态在导致感染复发中的关键作用。文章重点解析了I型毒素-抗毒素（TA）系统（如AapA1/IsoA1）调控此形态转换的分子机制，及其介导的免疫逃避和抗生素耐受性，为开发靶向TA系统等新型根除策略提供了重要见解。

　　

ABSTRACT

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是一种全球流行的病原体，与胃炎、消化性溃疡和胃癌密切相关，全球超过半数人口受其感染。其螺旋形态的定殖和致病机制已较为明确，但该细菌在应激条件下转变为球状（coccoid）形态的能力仍充满谜团。本综述探讨了球状形态在幽门螺杆菌感染复发中的作用，强调其作为一种可存活但非可培养（Viable but Non-Culturable, VBNC）状态，有助于细菌持续存在、免疫逃避和再感染。我们重点介绍了I型毒素-抗毒素（Toxin-Antitoxin, TA）系统，特别是AapA1/IsoA1对，在调控球状形态转换中的新作用。AapA1/IsoA1系统促进了向球状形态的转变，该形态能抵抗常规诊断方法和抗生素。这种免疫逃避和抗生素耐受性导致了治疗失败和感染复发，即使在看似根除之后。靶向TA系统，以及其他因素如肽聚糖（Peptidoglycan, PGN）重塑，可能提高当前疗法的效力并降低复发率，为更有效长期管理幽门螺杆菌感染提供途径。

Introduction

幽门螺杆菌是一种微需氧的ε-变形菌纲成员，是最普遍且最具临床意义的人类病原体之一，与慢性胃炎、消化性溃疡病和胃腺癌有关。其螺旋形态——特征为紧密缠绕的螺旋形状——便于其在胃黏液层中运动和穿透。这种结构形态，连同鞭毛运动以及诸如CagA和VacA等毒力因子，使其能有效定殖于胃上皮。然而，在不利条件下，如营养限制、抗生素暴露或氧化应激，幽门螺杆菌会经历从特征性螺旋形态到球形球状形态的显著形态转变。尽管经过数十年研究，球状形式的生物学意义仍是持续争论的话题。一些研究将其描述为与细胞退化或死亡起始相关的状态，而另一些则提供了令人信服的证据，支持其作为一种VBNC表型——细胞保持存活但无法通过标准培养方法检测——能够在恶劣条件下持续存在。

世界卫生组织虽于2024年将克拉霉素耐药幽门螺杆菌从其抗生素开发优先列表中移除，但基于现有证据和专家共识，该病原体仍具有重要的临床意义。根除治疗后复发率每年在5%到20%之间，表明某些细菌亚群可能逃避常规检测和清除。在此背景下，球状形态已成为持续存在和复发的潜在贡献者。值得注意的是，球状幽门螺杆菌在胃活检样本和环境储库（包括水源）中均被识别出，它可以在标准培养基上无法培养的情况下存活很长时间。最近的分子水平研究表明，向球状形态的转变越来越与肽聚糖结构改变和应激反应通路激活相关。特别是I型TA系统的参与，作为细菌持久性的潜在介质引起了兴趣。

Coccoid formation: Triggers and morphological transition

幽门螺杆菌从特征性螺旋形态向球状形态的转化代表了对应激的多方面适应，反映了细菌在恶劣条件下生存的保守策略。一系列环境和治疗触发因素——包括营养剥夺、延长孵育、温度波动以及暴露于亚最小抑制浓度（sub-MIC）的抗生素（如阿莫西林和克拉霉素）——已被证实可驱动这种形态转变。抗生素应激尤其会加速球状转化：例如，β-内酰胺类抗生素损害肽聚糖合成，并在数天内促进球形细胞的出现。氧化应激，特别是通过暴露于过氧化氢（H₂O₂）等活性氧物种，也被确定为球状状态的有效诱导剂，表明氧化还原介导的细胞重塑参与了这一转变。

从螺旋形到球形的转变似乎是通过一系列中间形态类型（弯曲杆状、U形细胞，最终是球形）进行的，表明这是一个时间调控的、而非突然的转化。超微结构分析已描绘出至少两种不同的球状亚型：A型，特征是不规则表面和紧密的细胞间接触；B型，表现出光滑的膜和更完整的细胞结构。这种形态异质性受诱导应激源性质和强度的影响。例如，阿莫西林诱导的球状体通常比稳定期形成的球状体更小，暗示了不同的潜在生理状态和可能不同的功能能力。

有趣的是，在某些球状形式中观察到电子致密颗粒——被鉴定为多聚磷酸盐内含物——支持了一种休眠模型，其中这些结构可能在长期存活期间充当代谢储备库。

Viability and persistence of the coccoid form

球状幽门螺杆菌的存活能力仍是其假设在感染复发中起核心作用的关键争议问题。早期研究认为球状体代表一种退化状态，援引了DNA/RNA含量减少、膜电位丧失和缺乏阶段特异性蛋白的证据。然而，这些发现与活跃DNA合成的证据形成对比，例如在3个月大的球状体中溴脱氧尿苷（BrdU）的掺入以及蛋白质组分析中更高水平的DNA旋转酶亚基（GyrA, GyrB）。代谢活动，尽管 reduced，在球状体中持续存在，ATP水平在9-13天大的细胞中可检测到，并在营养补充时增加，支持了一种休眠而非死亡的状态。电子显微镜进一步揭示了某些球状体中完整的膜和鞭毛，挑战了退化论的说法。

VBNC状态，其特征是具有代谢活性但在标准培养基上不可培养，为调和这些观察结果提供了一个令人信服的框架。超过85种细菌物种，包括51种人类病原体，表现出VBNC行为，幽门螺杆菌是其中之一。复苏研究提供了诱人的证据：有报道称，20天大的球状形态在雄性BALB/c小鼠中恢复为螺旋形态，导致成功的胃定殖和相关组织病理学改变。然而，由于残留螺旋细胞污染的可能性以及不一致的体外复苏，怀疑依然存在。

球状形式的持久性进一步得到根除治疗后胃活检中其检测结果的支持，这通常与治疗失败相关。重要的是，幽门螺杆菌的球状形式在临床实践中带来了重大的诊断挑战。由于球状细胞通常是VBNC，标准的基于培养的方法通常无法检测到它们的存在，导致假阴性结果。此外，依赖于脲酶活性的尿素呼气试验可能产生假阴性结果，因为球状形式与螺旋形式相比，脲酶活性显著降低或缺失。同样，粪便抗原检测对球状幽门螺杆菌的敏感性可能较低，因为这种形态状态下表面抗原的改变或下调。虽然PCR等分子技术可以检测细菌DNA而不管其存活与否，但它们无法区分活细胞和死细胞，使阳性结果的解释复杂化。

除了诊断挑战，球状形式的独特生理学也赋予了额外的生存优势，使根除努力复杂化。抗生素耐受性是VBNC状态的一个标志，在球状体中很明显，它们通过改变肽聚糖结构和降低敏感性来逃避β-内酰胺类药物的效应。免疫逃避是另一个优势，因为球状体与螺旋形式相比免疫原性降低，可能使它们能够在宿主体内未被察觉地持续存在。具体而言，一项研究表明，幽门螺杆菌的球状形式引发体液免疫反应，IgG抗体识别球状和杆状形式。在某些患者群体中，对球状形式的抗体反应甚至强于对螺旋形式的反应，表明免疫系统确实识别这种形态变体。然而，尽管有这种免疫识别，球状形式仍能持续存在，表明它可能具有逃避有效免疫清除的机制。一种可能的机制是其改变的细胞组成；已发现球状形式含有高水平的脂肪酸和胆固醇，这可能赋予其对免疫效应物的抵抗力并有助于其在宿主体内的存活。

此外，球状形式在幽门螺杆菌生物膜的形成和持续存在中起着关键作用。生物膜是附着于表面并嵌入细胞外聚合物基质中的结构化细菌群落。在这些生物膜内，大多数幽门螺杆菌细胞采用球状形态，这与休眠和对抗生素的耐受性增加有关。这种生物膜生活方式增强了细菌在胃环境中持续存在的能力，并可能 contribute to 根除治疗的失败。生物膜内向球状形式的转变由涉及肽聚糖重塑和应激反应的特定基因（如uppS和pgdA）促进，这些基因在生物膜条件下上调。

Molecular mechanisms behind coccoid formation

幽门螺杆菌向其球状形式的转变涉及复杂的分子变化，特别是在肽聚糖（PGN）层——赋予细菌形状的结构。有趣的是，幽门螺杆菌依赖于参与PGN合成和重塑的相对较少的基因集合，使其成为探索细菌如何改变形状的有用模型。这一过程中的关键参与者是青霉素结合蛋白（PBPs），如PBP1、PBP2和PBP3，它们负责组装PGN。实验表明，去除PBP1或破坏PBP2或相关蛋白MreC会导致球形（球状）细胞的形成。除此之外，一组PGN修饰酶——Csd1、Csd2、Csd3（也称为HdpA）、Csd4和Csd6——通过切割和重塑PGN组分来精细调整细菌的螺旋形状。

Csd3/HdpA具有两种 distinct 酶活性——D,D-内肽酶和D,D-羧肽酶——并在重塑细胞壁中起核心作用。当Csd3过表达时，球状形成加速；当它缺失时，该过程减慢或根本不发生。这指出了其在 loosening PGN结构中的关键功能。一些球状细胞积累一种特定的PGN片段，称为 muropeptide。尽管其在形状转变中的确切作用尚未完全清楚，但它可能帮助细菌避免免疫检测。

关于球状形式如何产生有两种主要理论。一种认为，简单地 loosening PGN 允许内部压力将细胞推成球形。另一种提出了一个更动态的场景：loosening 和新的PGN合成同时发生。对此的支持来自对中间U形细胞的观察，这意味着细胞壁在转变过程中被 actively remodeled。细胞骨架也起作用。MreB和CcmA等蛋白对于维持细菌的螺旋形状至关重要。当MreB被破坏时，细胞延长的 machinery 变得 disorganized。同样，CcmA的缺失去除了幽门螺杆菌的特征性扭曲，与水解酶活性结合，可能导致球状状态。

一个特别令人兴奋的进展是发现了毒素-抗毒素（TA）系统，特别是AapA1/IsoA1对，作为球状形成的触发因素。该系统的调控非常复杂，涉及多个转录后层面以防止意外的毒素表达。aapA1基因最初被转录成一个稳定的、全长的mRNA，它通过一个二级结构被保持在翻译失活状态，该结构隐藏了其核糖体结合位点。激活需要随后的3"末端加工事件，该事件将mRNA重新折叠成可翻译的形式。然后，这种活跃的信息受到IsoA1抗毒素的严格控制，IsoA1是一种反义RNA，通过特定的‘kissing-loop’相互作用与其靶标结合。这种结合形成了一个双链体，既物理阻断翻译，又标记毒素mRNA以供RNase III快速降解，确保毒素在正常生长条件下不产生。

这种通过3"末端加工进行翻译激活的策略首次在质粒R1的Hok/Sok系统中被描述。这种截断触发了AapA1 Tr1中的关键结构重排，暴露了核糖体结合位点，使mRNA具有翻译活性。这种TA介导的通路提供了环境线索与形态适应之间的直接联系。该系统被幽门螺杆菌在宿主中遇到的应激源激活，特别是炎症期间产生的氧化应激。应激通过抑制IsoA1抗毒素的产生来破坏保护性平衡，从而释放AapA1毒素。毒素肽然后作用于内膜，诱导快速转变为球状形态。关键的是，这种转变不会破坏细胞；冷冻电子显微镜显示，产生的球状体具有完整的膜，并且没有遭受膜电位或ATP的重大损失。

除了AapA1-IsoA1，幽门螺杆菌还含有几个II型TA系统，包括HP0892-HP0893、HP0894-HP0895、HP0315-HP0316、HP0967-HP0968和TfiT-TfiA，它们通过 arrest 生长和降低可培养性同时保持细胞存活来参与细菌持久性。这些系统通过靶向 essential 细胞过程（如复制、转录、翻译和细胞壁合成）来 contribute to 持久性。在某些情况下，这种靶向与在细胞内细菌亚群中观察到的形态变化有关，表明其在宿主细胞内长期存活中可能起作用。由TA系统促进的幽门螺杆菌球状形式可能在免疫逃避中起关键作用。细胞内持久性，如高HP0315表达所见，允许幽门螺杆菌隐藏在宿主细胞内，进一步逃避免疫检测。这种以休眠状态持续存在的能力可能导致慢性和复发性感染，对治疗构成重大挑战。

杀菌抗生素，如阿莫西林、左氧氟沙星和甲硝唑，诱导氧化应激，从而激活TA系统并促进球状形成。这种形态转变可能通过降低代谢活性来减少细菌对抗生素的敏感性，使得抗生素更难靶向活跃的细胞过程。这种机制可以解释为什么幽门螺杆菌感染难以根除以及为什么即使没有遗传耐药性突变也会复发。与利福平或四环素等抑菌抗生素不同，它们不显著诱导AapA1表达，杀菌抗生素加速向球状形式的转变，将TA系统直接与抗生素耐受性联系起来。

The coccoid form and the recurrence of H. pylori infection

根除治疗后幽门螺杆菌感染的复发仍然是一个主要的临床障碍，受抗生素耐药性、患者依从性以及细菌以非可培养形式持续存在的能力等因素影响。最近的证据表明，球状形式由于毒力基因（如cagA和vacA）表达下调而表现出 reduced 细胞毒性。值得注意的是，具有较低毒力特征的菌株（例如cagA^?, vacAs2/m2）显示出更大的球状转化倾向，表明这种形态作为一种应激适应性生存策略。这种持续存在增加了再感染的可能性，从而解释了患者即使在看似根除后仍经常观察到的复发。

研究表明，治疗后几周内的复发并不总是表明新的感染，而是未能完全消除原始菌株，该菌株可能已进入球状形式，导致感染再燃。这突出了治疗效力的重要性：低效力疗法通常导致较高的复发率，而高效力疗法则显著降低再感染机会。此外，球状形式的持续存在不仅与治疗效力有关，还与体内这些形式可以存活的潜在储库有关。口腔，特别是龈沟，已被确定为球状幽门螺杆菌的一个 such 储库。这些形式，虽然毒力较低但仍可存活，经常在胃部感染患者中检测到，表明口腔可能是再感染的重要部位。这对于口腔卫生不良或未通过治疗完全根除感染的患者尤其如此。因此，改善口腔卫生可能通过降低从口腔储库再感染的可能性，在预防复发中发挥重要作用。

Conclusion and future directions

幽门螺杆菌的球状形式已成为感染持续和复发的关键因素，主要通过其VBNC状态，使其能够在抗生素压力和环境应激下存活。本综述整合了越来越多的证据，表明球状体不仅仅是退化的最终形式，而是构成了一个多样化和动态的群体，其中某些子集保留了复苏和随后再感染的潜力。关键的环境触发因素——如抗生素暴露和氧化应激——驱动这种形态转变。这些变化通过包括PGN重塑酶（例如Csd3/HdpA）和最近表征的AapA1/IsoA1 TA系统等机制介导，该系统将环境感应与结构适应联系起来。球状形式逃避免疫检测和耐受抗生素的能力将其定位为一个潜在的储库，能够在胃部生态位或外部环境中持续存在，最终导致复发。

尽管取得了相当大的进展，一些实验局限性仍然阻碍了对球状体感染性的完整理解。例如，某些报道球状形式定殖的体内研究可能涉及残留螺旋细胞的污染，这使对真实球状体存活能力的解释复杂化。为解决这个问题，未来的研究应优先使用经过充分验证的纯化方案和分子验证技术，以确保观察到的定殖 solely 源于球状群体。澄清这个问题对于准确确定球状幽门螺杆菌在复发性感染中的作用以及推进靶向治疗策略至关重要。

尽管如此，几个关键问题仍未得到解答。这些包括确定促进球状体复苏的确切条件，厘清PGN重塑与TA系统各自的贡献，以及确定球状体在复发性感染中的真实流行率。新兴且可行的工具——例如通过批量RNA测序在 defined 应激条件下进行转录组分析以表征球状转变和复苏过程中的基因表达动态，以及重现人胃微环境的类器官感染模型以评估球状体存活、免疫逃避和抗生素耐受性——为解决这些差距提供了有希望的途径。

作为未来的方向，可以开发靶向治疗策略来特异性破坏球状形成、持续存在或复苏。例如，抑制肽聚糖修饰酶如AmiA和Csd3——细胞壁重塑的关键介质——已被证明会损害球状转化并使幽门螺杆菌对抗生素敏感。此外，靶向TA系统，特别是AapA1/IsoA1模块，可能 prevent 球状形式中休眠和抗生素耐受性的建立。这些方法代表了未来研究的有希望途径，并可能为能够根除螺旋和球状两种形式幽门螺杆菌的下一代疗法铺平道路。

鉴于抗生素耐药性挑战日益严峻，更深入地了解球状形式在幽门螺杆菌持久性中的作用至关重要。这些见解可以显著加强当前的治疗方案，并有助于减轻该病原体造成的全球健康负担。

Data availability statement

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