新型四环素衍生物Zifanocycline对脓肿分枝杆菌的体外抗菌活性及联合用药研究

《Infectious Diseases》：In vitro Activity of the Novel Tetracyclines Derivative, Zifanocycline Against Mycobacterium abscessus

本研究首次系统评估了新型氨基甲基环素类抗生素Zifanocycline对脓肿分枝杆菌(M. abscessus)的体外抗菌活性。结果显示：Zifanocycline的MIC50/MIC90(0.06/0.25 mg/L)显著优于替加环素和奥马环素，且与7种常用抗分枝杆菌药物联用均显示无关作用。该研究为治疗多重耐药的脓肿分枝杆菌感染提供了新的候选药物。

　　

Abstract

本研究旨在评估新型四环素衍生物Zifanocycline对脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)的体外抗菌活性。脓肿分枝杆菌作为非结核分枝杆菌(NTM)的重要病原体，对多种抗生素具有天然耐药性，临床治疗成功率低，亟需开发新型有效药物。

Introduction

脓肿分枝杆菌可分为三个亚种：脓肿亚种(abscessus)、博莱亚种(bolletii)和马赛亚种(massiliense)。该菌对多数抗生素类别具有高水平固有耐药性，导致感染难以治疗。全球范围内，囊性纤维化人群和非囊性纤维化人群中的脓肿分枝杆菌感染报告日益增多。针对脓肿分枝杆菌肺病的综合治疗分析显示，治愈率仅为45%，其中马赛亚种治愈率(57%)高于脓肿亚种(33%)。因此，开发新型抗感染药物迫在眉睫。

Zifanocycline是一种广谱第三代四环素类药物，被特异性分类为氨基甲基环素(aminomethylcycline)。该抗菌药物目前正在开发中，用于治疗社区获得性细菌性肺炎(CAP)、急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(ABSSSI)以及复杂性腹腔内感染(cIAI)。Zifanocycline通过抑制细菌核糖体的正常功能，有效克服多种常见四环素耐药机制。其独特的3-甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷侧链可能在某些四环素耐药机制中发挥作用，类似于替加环素的C9延伸，可限制核糖体保护蛋白(RPP)如Tet(M)进入主要四环素结合位点。该化合物独特的C9延伸导致与30S核糖体亚基的特定相互作用模式，并能与16S rRNA的磷酸基团形成直接、稳定的相互作用，这与替加环素等第三代四环素有所不同。这种独特的相互作用可能导致针对细菌靶点的功效和新作用机制的差异，从而增强该化合物在治疗抗生素耐药感染中的治疗应用。

Zifanocycline已于2015年12月完成I期临床开发，评估了其在健康受试者中的安全性、耐受性、药代动力学和多剂量递增研究。药代动力学/药效学(PK/PD)指数，特别是浓度时间曲线下面积(AUC)与最低抑菌浓度(MIC)的比值，与有效性密切相关。动物研究获得的药代动力学结果与健康受试者的单次和多次递增剂量试验结果一致，从而证实了Zifanocycline在临床研究中每日一次口服和静脉给药的有效性。然而，Zifanocycline对脓肿分枝杆菌的抗菌活性尚未得到系统评估。

Materials and Methods

Collection and Culture Conditions of M. abscess Isolates

本研究纳入2019年至2024年间嘉兴学院附属医院收治的具有下呼吸道感染临床症状患者的痰液和支气管肺泡灌洗液样本。样本在添加10%油酸-白蛋白-葡萄糖- catalase的Middlebrook 7H10肉汤中于37°C培养。使用MODI-TOF MS质谱仪鉴定非结核分枝杆菌(NTM)阳性培养物，并初步分类为脓肿分枝杆菌菌株。共收集67株脓肿分枝杆菌，排除重复菌株(即同一患者的多个菌株)。本研究已获得嘉兴学院附属医院机构伦理委员会批准(伦理批准号：2024-LY-400)。

Identification of M. abscessus Subspecies and Determination of the erm41 Gene Polymorphism

使用基于磁珠的细菌基因组DNA提取试剂盒从脓肿分枝杆菌阳性培养物中提取基因组DNA。使用150-bp双端Illumina NovaSeq X Plus平台进行全基因组测序。使用SPAdes软件进行从头组装。使用ANI Calculator计算平均核苷酸一致性(ANI)值。使用ResFinder数据库分析脓肿分枝杆菌，鉴定erm41基因。使用SnapGene软件将所有菌株与脓肿分枝杆菌脓肿亚种ATCC 19977的erm41基因序列进行比对，确定erm41基因第28个核苷酸的C/T多态性。

Antimicrobial Susceptibility Tests

药敏试验按照2018年CLSI M24文件指南进行。从M7H10琼脂平板中选择脓肿分枝杆菌单菌落，用无菌盐水稀释至0.5麦氏标准，再用阳离子调节Mueller-Hinton肉汤(CAMHB)调整细菌负荷至1×10⁵至5×10⁵ CFU/mL。所有抗菌药物在96孔微孔板中用CAMHB进行1:2系列稀释，每孔加入100 μL细菌悬液。Zifanocycline、替加环素、奥马环素、贝达喹啉、氯法齐明和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的最终浓度范围为0.015至32 mg/L；多西环素、莫西沙星、环丙沙星和克拉霉素的最终浓度范围为0.03至64 mg/L；阿米卡星、利奈唑胺和亚胺培南的最终浓度范围为0.06至128 mg/L；头孢西丁的最终浓度范围为0.12至256 mg/L。药敏板在37°C培养3-4天，直至对照孔观察到明显生长。本研究使用耻垢分枝杆菌ATCC 700686和金黄色葡萄球菌ATCC 29213作为参考菌株以确保测试药品质量。克拉霉素的MIC在培养3天和14天后进行评估，以确定是否存在对克拉霉素的诱导耐药性。使用脓肿分枝杆菌ATCC 19977作为MIC比较的参考菌株。所有药物的质量控制和结果解释均按照2018年CLSI M62指南中建立的折点进行。

Synergistic Antimicrobial Susceptibility Tests

使用微量肉汤稀释棋盘法评估Zifanocycline与7种常用抗分枝杆菌药物(克拉霉素、头孢西丁、利奈唑胺、贝达喹啉、阿米卡星、亚胺培南和莫西沙星)的体外联合效应。随机选择5株临床分离的脓肿分枝杆菌进行本研究。使用96孔无菌微孔板，每种抗菌药物从2倍MIC开始，在无菌CAMHB中进行系列稀释，通常进行8个稀释度。每个稀释度50 μL在板的行和列中排列。随后，将100 μL细菌悬液小心加入无菌微孔板，确保最终浓度为5 × 10⁵ CFU/mL。然后将微孔板培养72小时。培养期结束时，将成功抑制细菌生长的浓度确定为MIC。根据药物联合前后MIC值的差异计算部分抑菌浓度指数(FICI)。FICI公式表示如下：FICI = [(联合使用时Zifanocycline的MIC/单独使用Zifanocycline的MIC) + (联合使用时第二种抗生素的MIC/单独使用第二种抗生素的MIC)]。如果FICI ≤0.5，表示协同作用；如果在0.5至4之间，则认为无关；如果大于4，则提示拮抗作用。

Statistical Analysis

所有数据均使用Microsoft Excel 2021呈现。使用描述性统计方法计算脓肿分枝杆菌分离株的耐药率及相关变量。结果以计数和百分比表示。所有统计分析均使用SPSS Version 20进行。

Result

In vitro Activity of Zifanocycline and Comparators Against 67 M. abscessus Isolates

Zifanocycline对67株脓肿分枝杆菌分离株表现出强大的抗菌活性，MIC₅₀为0.06 mg/L，MIC₉₀为0.25 mg/L。在0.5 mg/L浓度下，Zifanocycline抑制了所有测试分离株的生长。

与其他广谱四环素抗生素相比，Zifanocycline (MIC₉₀, 0.25 mg/L)的MIC₉₀比替加环素(MIC₉₀, 0.5 mg/L)和奥马环素(MIC₉₀, 0.5 mg/L)低2倍。此外，贝达喹啉和氯法齐明对脓肿分枝杆菌分离株的MIC₉₀值均为0.5 mg/L，表明其抗菌活性与替加环素和奥马环素相当。阿米卡星(100%敏感性)和利奈唑胺(100%敏感性)在体外对脓肿分枝杆菌分离株表现出优异的抗菌活性，MIC₅₀和MIC₉₀值分别为2 mg/L, 4 mg/L和2 mg/L, 8 mg/L。根据CLSI折点，测试分离株对头孢西丁表现出中等敏感性(52.24%敏感性)。然而，环丙沙星(4.48%敏感性)、莫西沙星(25.37%敏感性)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(35.82%敏感性)、多西环素(2.99%敏感性)和亚胺培南(0%敏感性)根据CLSI折点对测试分离株显示出相对较低的抗菌活性。

Zifanocycline对57株具有erm41 T28基因型(介导对克拉霉素的诱导耐药)的脓肿分枝杆菌脓肿亚种分离株的MIC₅₀和MIC₉₀ consistently为0.06 mg/L和0.25 mg/L。

Zifanocycline is Compatible with the Most Commonly Utilized Drugs for Treating M. abscessus Infections

通过微量肉汤稀释棋盘滴定法评估了Zifanocycline与七种常用抗分枝杆菌药物(亚胺培南、克拉霉素、莫西沙星、利奈唑胺、头孢西丁、贝达喹啉和阿米卡星)的相容性，并使用了五株随机选择的临床脓肿分枝杆菌分离株。观察到Zifanocycline与上述抗分枝杆菌药物之间存在无关效应。

Discussion

脓肿分枝杆菌是引起肺病的第二常见非结核分枝杆菌(NTM)病原体，被广泛认为是最耐药的分枝杆菌之一。研究报告显示，脓肿分枝杆菌引起的感染总体增加了64.7%，疾病发病率增加了25%。脓肿分枝杆菌肺病患者在5年、10年和15年的累积死亡率分别为11.4%、29.8%和50.0%，对于一种通常不列为传染病的疾病来说，这是一个异常高的死亡率。

现有的含大环内酯类的多药化疗方案在治疗脓肿分枝杆菌方面疗效有限，凸显了开发新治疗策略的迫切性。迄今为止，已评估了几种可能对脓肿分枝杆菌表现出抗菌活性的创新药物，包括喹诺酮类药物西他沙星以及恶唑烷酮类药物利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺。西他沙星对脓肿分枝杆菌表现出优于其他喹诺酮类药物的抗菌活性(MIC₅₀/MIC₉₀, 1/2 mg/L)。尽管利奈唑胺已被证明在体外和体内对脓肿分枝杆菌具有良好的活性，但由于骨髓抑制和周围神经病变等副作用，其作为长期口服治疗选择受到限制。尽管特地唑胺在骨髓抑制和神经毒性方面似乎更安全，康替唑胺在骨髓抑制方面也更安全，但需要进一步的临床研究来确认其长期使用的安全性。

近期研究表明，新型四环素衍生物替加环素、奥马环素和依拉环素对脓肿分枝杆菌分离株表现出更显著的抗菌活性。最新的四环素衍生物之一Zifanocycline，对鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性优于替加环素和奥马环素。然而，其对脓肿分枝杆菌的抗菌活性尚未探索。本研究评估了Zifanocycline及其对照药物对67株脓肿分枝杆菌的体外抗菌活性。结果表明，Zifanocycline与其他对照药物(包括β-内酰胺类、氟喹诺酮类和磺胺类)相比表现出显著优势。Zifanocycline的MIC₅₀为0.06 mg/L，比奥马环素低4倍，比替加环素低2倍；其MIC₉₀为0.25 mg/L，比奥马环素和替加环素均低2倍。与奥马环素相比，Zifanocycline对脓肿分枝杆菌表现出更优的体外抗菌活性。此外，Zifanocycline和奥马环素均有口服和静脉注射剂型，口服剂型在提高患者依从性方面具有优势，适用于需要长期给药以达到治疗效果的脓肿分枝杆菌相关疾病。在治疗脓肿分枝杆菌感染的临床研究中，超过75%的患者在接受含奥马环素的化疗方案后出现临床改善，相对安全的连续使用中位时间长达6-8个月。直接归因于该治疗的主要不良反应是恶心和呕吐；然而，一部分患者对这些副作用耐受良好。在一项简短的药代动力学研究中，确定Zifanocycline在每日剂量高达200 mg时是安全且耐受性良好的。然而，关于其长期安全性的临床研究明显缺乏。

脓肿分枝杆菌的一个显著固有耐药决定因子是诱导型大环内酯类erm41基因，该基因编码一种甲基化酶，可修饰核糖体，这是治疗脓肿分枝杆菌感染的基石药物克拉霉素和阿奇霉素的靶点。erm41基因在脓肿分枝杆菌马赛亚种中无功能；然而，在脓肿分枝杆菌博莱亚种和脓肿亚种中，该基因的第28个核苷酸表现出(C/T)多态性，只有erm41 T28变体介导大环内酯类耐药。此外，脓肿分枝杆菌对许多抗菌药物表现出固有和获得性耐药，难以克服。因此，由脓肿分枝杆菌引起的感染通常需要多种药物联合治疗。然而，多项研究表明，主要包含大环内酯类、阿米卡星和β-内酰胺类的推荐多药治疗方案，仅在25%至26%的非囊性纤维化脓肿分枝杆菌脓肿亚种感染患者中实现痰培养转阴，随后复发率高达17%至55%。Zifanocycline对具有erm41 T28基因型的脓肿分枝杆菌脓肿亚种的MIC₅₀和MIC₉₀值确定为0.06 mg/L和0.25 mg/L，这与所有分离株的MIC₅₀和MIC₉₀结果一致。因此，大环内酯类诱导的耐药性不会损害Zifanocycline的体外抗菌活性。协同抗菌药敏试验观察到Zifanocycline与其他七种常用抗分枝杆菌药物之间存在无关效应，这有助于灵活调整抗分枝杆菌治疗方案以达到最佳治疗效果。

Conclusion

总之，Zifanocycline对脓肿分枝杆菌显示出显著的抗菌效力，并且在体外与其他抗脓肿分枝杆菌治疗药物联合时观察到无关效应。因此，Zifanocycline可能是一个有前景的选择，可纳入新的脓肿分枝杆菌治疗方案中。

Ethics Approval

本研究遵循《赫尔辛基宣言》制定的涉及人类参与者研究指南的伦理标准进行。此外，该研究获得了嘉兴学院附属医院伦理委员会的必要伦理许可。该授权的批准参考号为2024-LY-400，表明所有方案都经过审查并满足此类调查所需的伦理考虑。

Disclosure

我们强调这项研究没有任何利益冲突。所有作者均确认他们不存在可能影响本研究结果的财务或个人关联。

Data Sharing Statement

支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者Wang Wei处获取。此外，我们研究的原始序列读数可在NCBI网站上找到，目录编号为BioProject accession number PRJNA1257363。我们鼓励其他研究人员使用我们的数据以促进进一步的科学研究。