吸烟与口腔健康视角下肺脓肿中Tannerella forsythia的mNGS鉴定：诊断挑战与临床启示的回顾性研究

本研究通过回顾性病例分析，首次系统报道了4例经宏基因组下一代测序（mNGS）确诊的Tannerella forsythia肺脓肿病例，揭示了吸烟与口腔疾病作为潜在风险因素的重要性，并凸显mNGS在难培养厌氧菌诊断中的突破性价值。

　　

Abstract

本研究旨在通过四例病例分析，探讨与Tannerella forsythia（T. forsythia）相关的肺脓肿的临床特征、诊断挑战及治疗结局。T. forsythia是一种常见于牙周炎患者口腔的革兰氏阴性厌氧菌，但由其引起的肺脓肿在文献中极为罕见。

Patients and Methods

我们回顾性分析了2023年4月至2024年5月期间收治的四例患者，这些患者均经胸部计算机断层扫描（CT）证实为肺脓肿，并通过支气管肺泡灌洗液（BALF）的宏基因组下一代测序（mNGS）检测到T. forsythia。尽管进行了常规培养，但结果均为阴性。分析了包括人口统计学、症状、影像学表现和治疗方案在内的临床数据。

Results

所有患者均存在口腔疾病，75%为长期吸烟者。主要临床表现为非特异性呼吸道症状，包括咳嗽、发热、胸痛和咯血。胸部CT显示肺上叶实变和空洞形成。BALF的mNGS成功检测到T. forsythia，而常规培养在所有病例中均未能识别病原体。所有患者均接受了基于甲硝唑和哌拉西林-他唑巴坦的联合抗生素治疗，部分病例需要额外使用其他抗生素。治疗后观察到显著的临床改善，随访影像显示病灶逐渐消退。

Conclusion

本研究受限于样本量小且缺乏验证性试验，需要在更大的前瞻性队列中进行验证。我们的发现突出了mNGS在检测苛养菌（如厌氧菌T. forsythia）方面的优势，为未来类似感染的诊断提供了新见解。此外，结果确定了吸烟和口腔健康状况不佳是可能与T. forsythia相关肺脓肿发生相关的共同特征。

Introduction

Tannerella forsythia（T. forsythia）是一种革兰氏阴性厌氧菌，1986年由Tanner等人首次从牙周炎患者的口腔中分离出来。它被认为是导致牙周炎的主要病原体之一。与牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）和齿垢密螺旋体（Treponema denticola）一起，T. forsythia构成了“红色复合体”（red complex），这是一组定植于牙菌斑生物膜的细菌。厌氧菌是肺部感染的常见病原体，通常由误吸引起。它们也是社区获得性肺脓肿的主要原因。关键在于，常规培养方法常常无法识别这些苛养微生物——这一诊断空白现在由宏基因组下一代测序（mNGS）填补。这种先进方法提供了一种无偏倚、高灵敏度的病原体检测手段，近期证据证实其在识别肺脓肿中厌氧/兼性厌氧菌方面优于常规方法。研究表明，厌氧性肺脓肿通常以厌氧链球菌、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）和产黑色素普雷沃菌（Prevotella melaninogenica）为主。然而，关于T. forsythia相关肺脓肿的临床特征尚无系统数据，仅有零星病例报告记载。这一深刻的知识空白凸显了我们研究的必要性。在此，我们呈现了四例经mNGS确诊的T. forsythia肺脓肿病例（迄今为止最大的系列），并强调了它们共同的临床和影像学特征。

Patients and Methods

Study Population

这项回顾性研究于2023年4月至2024年5月在浙江中医药大学附属杭州中医院进行。肺脓肿定义为计算机断层扫描（CT）上直径大于2厘米的空洞性病变。纳入标准：筛选研究期间所有经放射学确诊的成年（≥18岁）肺脓肿患者。排除标准：（1）临床/影像记录不完整；（2）病因明确为非感染性的脓肿（如恶性肿瘤、血管炎）。病原体鉴定方案：所有患者均进行了痰常规培养。当初始经验性抗生素治疗失败（72小时持续发热/影像学进展）时，进行支气管肺泡灌洗液（BALF）mNGS检测。纳入了四例经mNGS确认T. forsythia为主要病原体的病例。

Ethics Statement

杭州中医院伦理委员会批准了这项涉及回顾性查阅病历的工作（批准号：2024KLL215）。由于研究是回顾性的，伦理委员会放弃了征得研究参与者同意的要求。本研究遵循《赫尔辛基宣言》进行。所有患者数据均经过去标识化和匿名化处理以确保隐私和保密性。数据处理遵循医院的数据保护政策和相关伦理指南。

Data Collection

收集了每位患者的人口统计学特征、病史、临床症状、实验室检查和影像学结果。实验室检查包括全血细胞计数（CBC）、C反应蛋白（CRP）和降钙素原（PCT）水平。在入院时和随访期间进行CT扫描以评估疾病进展和治疗反应。所有患者均常规进行非增强胸部CT扫描，使用256层多探测器CT扫描仪，采用标准化协议：120 kVp，自动管电流调制，1.0–1.5 mm层厚，并使用肺窗（窗宽：1500 HU；窗位：-600 HU）和纵隔窗（窗宽：350 HU；窗位：40 HU）算法重建。所有患者均进行了对比增强CT，使用非离子型对比剂（碘海醇，350 mgI/mL），通过动力注射器以1.5 mL/kg体重剂量和2.5–3.0 mL/s流速注射，在门静脉期（注射后约60–70秒）进行成像。临床治愈的定义是所有基线症状（咳嗽、发热、咯血）缓解≥72小时，同时CRP恢复正常（<10 mg/L）。

Microbiological Analysis

通过支气管镜检查获取痰和BALF样本并进行常规细菌培养。此外，对BALF进行mNGS以识别微生物病原体。mNGS在杭州 Matridx 生物技术有限公司进行，使用经过临床验证的方案：BALF样本经过机械匀浆（BSP-100振荡器，杭州 Matridx 生物技术有限公司），然后共提取总核酸用于DNA/RNA病原体检测；通过片段化和接头连接构建双文库，然后在Illumina NextSeq 550（2×75 bp）上测序。生物信息学分析涉及宿主DNA剔除（GRCh38.p13）以及使用KRAKEN2/Bracken针对组合的GenBank NT/NR加上精选的临床数据库（35,257个物种）进行微生物分类。病原体显著性要求：（1）映射到某个物种的独特读长≥10条，（2）同时满足相对丰度≥微生物读长的1%或RPM >5×阴性对照，以及（3）通过质量控制（Q30>80%，PhHV-1回收率≥80%）。

Results

General Characteristics

研究纳入四名患者（1名女性，3名男性），年龄46至68岁。三名患者有高血压病史，一名有酒精性肝病，一名有糖尿病。三名患者有长期吸烟史，所有患者均有牙周炎（n=3）或龋齿（n=1）。两名患者有饮酒史。四名患者均未接受免疫抑制治疗，包括糖皮质激素。

Clinical Manifestations of the Onset

所有患者均出现呼吸道症状，最显著的是咳嗽和咳痰（4/4, 100%），而体温>38°C和胸痛各占病例的50%（2/4, 50%）。值得注意的是，三名患者（3/4, 75%）观察到咯血。两名患者（病例2和3）同时表现出咯血和高热（≥39°C）。

Laboratory and Radiological Findings

病例1（白细胞计数WBC: 17.2×10⁹/L）、病例2（WBC: 12.4×10⁹/L）和病例4（WBC: 17.7×10⁹/L）观察到白细胞增多，而病例3的白细胞计数正常。所有患者的CRP水平均显著升高（范围：54.9–110.0 mg/L）。所有病例的PCT均保持在正常范围内（≤0.08 ng/mL）。四名患者肺脓肿的位置如下：三例在左肺上叶，一例在双肺上叶。影像学上，所有病例均存在实变和空洞。其他发现包括空气支气管征（2/4）、胸腔积液（1/4）、钙化（1/4）和纵隔淋巴结肿大（1/4）。三名患者进行了对比增强胸部CT，均显示不均匀强化伴中央无强化低密度区，提示坏死成分。

Microbiological Findings

所有病例的痰和BALF常规培养均为阴性。然而，mNGS在所有患者中均鉴定出T. forsythia为主要病原体，序列数范围从32383到249236。还观察到其他口腔病原体（如牙龈卟啉单胞菌、Socranskii密螺旋体、直肠弯曲杆菌）和病毒（如EB病毒、巨细胞病毒）的共同检测。

Treatment Outcomes

所有四名患者均通过量身定制的抗生素方案达到预定义的临床治愈标准，但治疗疗程持续时间差异显著（17-92天）。初始静脉治疗（主要是哌拉西林-他唑巴坦联合甲硝唑）后，大多数病例转为口服治疗。病例2因并发症（咯血和反复发热）需要延长多药调整（92天），而其他病例显示出更快的反应。所有四名患者的预后均令人满意。影像学恢复滞后于临床改善。所有四名患者均实现了临床症状的完全缓解，三例病例观察到显著的影像学改善。尽管病例3的临床症状通过治疗得到解决，但在1周随访时影像学改善仍然有限。遗憾的是，该患者拒绝了后续推荐的胸部CT影像监测。在3个月的门诊复查中，病例3保持临床康复，无呼吸道症状，CRP正常化（2.1 mg/L）。虽然无法确认明确的影像学 resolution，但持续的健康状况支持治疗成功。

Discussion

肺脓肿代表肺实质内的局限性化脓性感染，以坏死空洞为特征，通常在影像学上显示气液平面。这些感染可进展为全身性受累，包括危及生命的脓毒症。虽然各种病原体可能导致肺脓肿，但当代研究表明需氧菌——特别是肠杆菌目、非发酵革兰阴性杆菌和革兰阳性球菌——在当前的病例系列中占主导地位。由于培养困难，厌氧性肺脓肿的诊断鉴定在临床上仍然具有挑战性。值得注意的是，T. forsythia是一种主要的厌氧口腔共生菌，已被充分确定为关键的牙周病原体。尽管其在口腔中普遍存在，但关于T. forsythia相关肺脓肿的临床数据仍然非常有限。据我们所知，这项研究首次系统描述了成人T. forsythia相关肺脓肿的特征，是迄今为止报道的最大病例系列。

在我们的病例系列中，四名患者中有三名（75%）有长期吸烟史，这使我们假设吸烟可能是T. forsythia相关肺脓肿的潜在风险因素。这一观察得到了现有文献的支持：Lv等人记录了一例慢性吸烟者中确诊的T. forsythia肺脓肿病例，而Stewart等人报告了另一名长期吸烟者中涉及T. forsythia、具核梭杆菌和疑似放线菌属的多微生物脓胸。牙周研究提供了机制上的见解，一项关键研究揭示了吸烟者和非吸烟者之间龈下微生物谱的显著差异。当前吸烟者表现出包括小单胞菌属、梭杆菌属、弯曲杆菌属和拟杆菌属在内的牙周病原体定植显著增加，且T. forsythia的检测仅存在于活跃吸烟者中。此外，Delima等人证明戒烟会导致各种口腔病原微生物水平降低。口腔病理与肺部厌氧感染之间的关联已有充分记载。先前的研究表明，口腔卫生不良与肺炎患者专性厌氧菌负荷升高相关，而牙齿状况不良已被独立认为与肺脓肿发展相关。基于这些证据，我们推测吸烟可能通过其对口腔微生物组组成和局部黏膜防御的有害影响，促进T. forsythia肺部感染。

肺脓肿根据感染途径通常分为吸入性肺脓肿和血源性肺脓肿。血源性肺脓肿通常由需氧菌（如金黄色葡萄球菌）通过血流传播引起。病灶为多发且无固定分布模式，这与误吸相关的厌氧菌感染和局灶性分布显著不同。口咽分泌物的误吸是口腔厌氧菌引起肺脓肿的主要机制，这一点得到了微生物学和临床证据的支持。基于T. forsythia的严格厌氧特性、其在龈下生物膜内的主要生态位、通过mNGS在所有病例中一致检测到指示口腔菌群多微生物感染的共病原体，以及脓肿 exclusively 位于上叶（3/4在左上叶，1/4在双上叶），我们提出误吸是本系列中T. forsythia最合理的转移途径。普遍存在的牙周炎/龋齿史（100%）和吸烟史（75%）可能通过潜在增加口腔细菌负荷（包括T. forsythia）并可能损害黏膜防御和呼吸道清除机制，从而促进误吸和随后的肺部感染建立。因此，这些患者中T. forsythia相关肺脓肿的发病机制可能涉及病原性口腔微生物群的误吸，并由潜在的口腔健康状况不佳和吸烟所促进。

在我们的病例系列中，患者表现为非特异性呼吸道症状，包括咳嗽、发热、胸痛和咯血。值得注意的是，我们发现咯血发生在3/4的病例中（75%），这一频率远高于典型肺脓肿的报道（10-20%）。两名患者（病例1和3）同时出现咯血和高热，提示严重的实质受累。所有四例病例均表现出牙周病变，三名患者患有牙周炎，一名患有龋齿。影像学上，所有脓肿均位于肺上叶，与Miao等人先前的报告一致。 exclusively 的上叶定位（左上叶：3例；双上叶：1例）与已确立的误吸解剖学相符。在卧位时，误吸的口咽分泌物倾向于流向依赖的肺区：上叶后段和下叶上段。这种分布被记载为误吸相关感染的特征。肺实变是主要的影像学发现，存在于所有四例病例（100%）。与Miao等人的发现相反，他们报道T. forsythia肺脓肿的炎症标志物为阴性，我们的系列显示了显著的全身性炎症：所有四名患者的CRP水平均显著升高，三例表现出白细胞增多，且所有四例的中性粒细胞百分比均升高。这种差异可能反映了疾病严重程度或宿主反应的差异。当前证据表明T. forsythia具有显著的促炎潜力。体外研究表明，T. forsythia感染在小鼠模型中会升高血清炎症标志物，这可能是通过其独特的粗糙型脂多糖（LPS）介导的，该LPS能有效激活巨噬细胞炎症反应。在我们所有患者中观察到的CRP显著升高与PCT水平正常之间的分离值得注意，并可能提供额外的病理生理学见解。PCT是一种对系统性细菌感染（特别是由需氧菌引起）高度特异性的生物标志物，并且在脓毒症中对内毒素（如LPS）的反应中被强烈诱导。相比之下，CRP是一种广泛的急性期反应物，在多种炎症条件下升高，包括局部感染。在我们的系列中，尽管存在显著的局部炎症（高CRP），但PCT水平正常，表明T. forsythia肺脓肿可能主要代表一种局部化脓性过程，没有显著的细菌播散或系统性内毒素介导的反应。这可能归因于病原体和感染的性质：（1）T. forsythia是一种引起包裹性脓肿的厌氧菌，可能限制炎症介质释放到体循环中；（2）T. forsythia独特的粗糙型LPS与革兰阴性肠道杆菌的强效内毒素相比，可能表现出不同的免疫刺激特性，后者是PCT的经典强效诱导剂。因此，T. forsythia肺脓肿中的生物标志物谱（CRP升高 + PCT正常）可能反映了对厌氧菌感染的强烈局部炎症反应，没有伴随的血流侵袭或经典脓毒症综合征。虽然脓肿的局部性质和T. forsythia LPS的独特免疫生物学提供了合理的解释，但这种分离的炎症反应背后的精确机制值得进一步研究。

作为一种营养苛养菌，T. forsythia需要外源性N-乙酰胞壁酸（MurNAc）用于生长和增殖。在口腔中，共生细菌如口腔链球菌和放线菌属通过特定的表面分子相互作用为T. forsythia提供必需的MurNAc和胞壁肽片段。Yoneda等人证明了牙龈卟啉单胞菌和T. forsythia之间的协同毒力，在小鼠模型中显示出增强的脓肿形成。这种病原体合作可能解释了我们的临床发现：所有四名患者的支气管肺泡灌洗液mNGS揭示了 alongside T. forsythia存在各种牙源性厌氧病原体的多微生物感染。在我们的研究中，通过mNGS在所有四名患者的BALF中检测到卟啉单胞菌属，且序列数很高。其中，两例鉴定出牙龈卟啉单胞菌，另外两例发现牙髓卟啉单胞菌。在几个病例中mNGS检测到EB病毒（EBV）和巨细胞病毒（CMV）需要谨慎解读。尽管病例3中读长数较高（EBV:4,329），但EBV/CMV共同检测的临床意义仍然有限。CT扫描未显示典型的病毒性肺炎模式，如弥漫性磨玻璃影或支气管周围增厚。最关键的是，所有患者在没有任何抗病毒治疗的情况下实现了完全临床康复，证明EBV/CMV对疾病过程没有显著贡献。

mNGS代表了一种先进的高通量核酸测序技术，已成为全面微生物鉴定的强大工具。与常规培养方法相比，mNGS显示出卓越的诊断灵敏度，特别是对于具有挑战性的病原体，包括结核分枝杆菌、病毒 agent、厌氧菌和真菌。值得注意的是，这与靶向分子方法（如16S rRNA测序或物种特异性PCR）形成对比。靶向16S rRNA测序可以高灵敏度地检测厌氧菌，但需要细菌通用引物，并且缺乏超越细菌的广泛病原体覆盖。类似地，物种特异性PCR（例如针对T. forsythia）提供高特异性，但需要先验的临床怀疑来选择引物。关键的是，两种方法在处理多微生物感染时都遇到困难，原因是引物偏倚和有限的多重检测能力。相比之下，mNGS的非靶向方法能够同时检测T. forsythia、共病原体和机会性病毒，而无需假设驱动的引物设计。在我们的回顾性分析中，在传统诊断方法（痰培养和支气管肺泡灌洗液培养）产生阴性结果的所有四例肺脓肿病例中，mNGS成功识别了致病病原体。该技术在检测多微生物感染方面提供特殊优势。肺脓肿通常是涉及多种细菌物种的混合感染的结果。鉴于肺脓肿通常由混合细菌感染引起，mNGS可能成为确定脓肿病因的重要诊断方式。然而，mNGS不能可靠地区分真实感染与微生物定植，需要临床医生将发现与临床表现和辅助检查（如影像学特征）相关联。与常规培养不同，mNGS目前无法提供抗生素敏感性数据。解读需要与临床背景仔细整合。mNGS的缺点还包括更高的成本和生物信息学复杂性。虽然存在这些局限性，但持续的技术进步可能会应对这些挑战， potentially 确立mNGS在肺部感染诊断中的基石地位。

选择合适的抗菌疗法对于肺脓肿的有效管理至关重要。在我们的研究中，在mNGS结果出来之前就开始了哌拉西林-他唑巴坦联合甲硝唑的经验性方案。根据2019年ATS/IDSA重症社区获得性肺炎指南，我们启动了哌拉西林-他唑巴坦的经验性治疗以覆盖潜在的铜绿假单胞菌和其他革兰阴性病原体，并因临床怀疑厌氧菌 involvement（例如误吸或提示脓肿/脓胸的影像学发现）而补充甲硝唑，等待mNGS结果。这种组合提供了针对常见需氧菌的广谱覆盖，同时确保了对厌氧菌的有效活性，鉴于上叶脓肿、口腔病理和误吸之间的强关联，这一点至关重要。值得注意的是，T. forsythia对抗生素磷霉素耐药，主要是由于缺乏MurAB酶，这些酶参与MurNAc的生物合成。与其他红色复合体细菌类似，T. forsythia frequently 携带tet(Q)和tet(32)基因，可能 confer 对四环素类抗生素（如多西环素）的耐药性。体外药敏试验证明T. forsythia对莫西沙星100%敏感，同时显示对阿莫西林和甲硝唑的耐药率分别为25.6%，对阿奇霉素的耐药率为21.0%。临床证据支持这些发现，一项在牙周炎患者中的试验显示，莫西沙星治疗后T. forsythia水平显著降低。对种植体周围炎症的其他研究报道了对甲硝唑普遍敏感，但对阿莫西林和克林霉素的耐药率约为20%，未观察到对阿莫西林和甲硝唑均耐药的菌株。随后的mNGS结果通过鉴定T. forsythia为主要病原体并在所有病例中揭示含有各种牙源性厌氧菌的多微生物感染， robustly 证实了我们经验性策略的合理性，这需要联合厌氧-需氧覆盖。在大多数病例（病例1、3和4）中，对初始方案的临床反应令人满意，并根据mNGS发现巩固了治疗。相比之下，对于具有严重症状（咯血和反复发热）的病例2，mNGS发现极高的T. forsythia序列数（249,236条读长）为进一步升级和延长抗菌治疗提供了微生物学基础。这种治疗方法在所有患者中均导致显著的临床改善。

我们系列中观察到的治疗持续时间的显著差异凸显了管理厌氧性肺脓肿的一个关键挑战：缺乏标准化的治疗持续时间指南。这一缺陷源于几个相互关联的因素。首先，历史上和持续存在的微生物学诊断困难——由于厌氧菌的苛养性和常规培养的低阳性率——阻碍了进行大规模、病原体特异性研究以建立循证持续时间。其次，疾病本身具有高度异质性；病例2中延长的92天疗程直接归因于严重症状的管理， specifically 大咯血和反复高热，这需要多次抗生素调整。值得注意的是，病例2也表现出最高的细菌负荷，反映在显著升高的序列数（249,236），这可能导致了更严重的临床表现和所需的延长治疗。相比之下，其他三名患者较短的疗程（17-56天）反映了对初始经验性治疗有利反应的 uncomplicated 临床过程。第三，停止抗生素的决定依赖于主观的临床评估和不完美的标志物，因为影像学 resolution notoriously 滞后于临床治愈，并且我们缺乏经过验证的微生物学根除生物标志物。虽然IDSA/ATS指南为社区获得性肺炎和肺脓肿管理提供了一般性建议，但缺乏定义厌氧性肺脓肿（特别是涉及像T. forsythia这样的苛养微生物）最佳治疗长度的具体循证方案。当前实践通常依赖于基于临床反应（症状缓解、发热消退）、炎症标志物正常化（例如CRP）和影像学改善的个体化决策。这种个体化方法，尽管考虑到患者因素和疾病严重程度的异质性而务实，但 inherently 导致抗生素暴露持续时间的显著 variation，如我们的病例所示。未来关注微生物学根除和组织愈合的客观标志物的研究有必要建立更循证的、标准化的厌氧性肺部感染持续时间推荐， potentially 减少不必要的抗生素暴露和相关风险。

这项研究有几个值得注意的局限性，需要明确强调：（1）选择偏倚风险：尽管连续筛查了所有肺脓肿患者，但最终队列选择依赖于mNGS确认的T. forsythia检测，可能 underrepresenting 培养阳性病例。（2）缺乏对照组：作为一项观察性病例系列，本研究缺乏比较组（例如非T. forsythia脓肿）。（3）未经验证的微生物学发现：缺乏对mNGS结果的验证性试验（PCR、免疫组化或培养）仍然是一个关键的方法学限制。（4）不完整的影像学随访：病例3缺乏长期CT，尽管临床康复，但无法进行明确的 resolution 评估。（5）回顾性单中心设计：样本量小（n=4）和机构特异性可能影响普遍适用性。总的来说，这些局限性需要谨慎解读研究结果。

Conclusion

本研究呈现了迄今为止报道的最大的T. forsythia相关肺脓肿病例系列（n=4）， serves as a hypothesis-generating exploration rather than definitive evidence。该队列中的关键观察包括：（1）伴随的口腔病理和吸烟史（75%）是常见的合并症；（2）临床表现是非特异性的，而胸部CT主要显示实变和空洞性病变；（3）mNGS被证明对快速病原体鉴定有价值；（4）在这些病例中，通过适当的抗菌治疗方案获得了良好的短期结局。这些发现产生了三个需要验证的关键假设：（1）口腔菌群失调作为T. forsythia肺部易位的潜在风险因素；（2）mNGS指导的治疗改善厌氧性脓肿结局；（3）吸烟增强T. forsythia毒力。为了验证这些机制并建立临床指南，迫切需要进行前瞻性多中心研究。

Disclosure

作者报告在本工作中无利益冲突。