基于光流控系统的抗原特异性功能性CD8+T细胞鉴定新技术：突破表位信息依赖性的免疫学研究

本研究针对当前T细胞免疫研究中对T细胞受体（TCR）与肽-主要组织相容性复合物（p-MHC）结合亲和力的过度依赖问题，开发了一种名为MicroFAST（微流控功能型抗原特异性单T淋巴细胞筛选）的新型光流控技术。该技术通过独立于表位信息的功能性筛选策略，成功分离出人巨细胞病毒（HCMV）和SARS-CoV-2特异性CD8+T细胞，并鉴定出多对特异性TCR及其对应表位。研究首次证实TCR-p-MHC结合亲和力与功能性无关，为工程化TCR-T疗法和T细胞疫苗开发提供了关键技术平台和理论依据。

　　

在免疫学研究领域，抗原特异性CD8⁺T细胞的鉴定一直是理解机体抗病毒和抗肿瘤免疫应答的关键。传统的检测方法主要依赖于T细胞受体（TCR）与肽-主要组织相容性复合物（p-MHC）多聚体的结合亲和力，然而这种方法存在明显局限：一方面需要预先知道具体的表位信息，另一方面无法区分具有结合能力但功能缺失的T细胞群体。更重要的是，越来越多的证据表明，TCR与p-MHC的结合亲和力并不能准确预测T细胞的实际功能表现，这为免疫监测和免疫治疗策略的开发带来了重大挑战。

为了解决这些问题，来自南方科技大学医学院第二附属医院的研究团队在《iScience》杂志上发表了一项创新性研究。他们开发了一种名为MicroFAST（微流控功能型抗原特异性单T淋巴细胞筛选）的新型技术平台，该平台基于Berkeley Lights公司的Lightning光流控系统，能够在不依赖表位信息的情况下，通过检测单个CD8⁺T细胞的功能性反应（IFN-γ分泌）来鉴定抗原特异性T细胞。

研究人员首先建立了MicroFAST的技术流程。该系统使用OptoSelect 1500芯片，每个纳米级培养室（NanoPen）可容纳一个CD8⁺T细胞、数个抗原呈递细胞（APC）和IFN-γ捕获微球。经过共培养后，通过检测微球上的荧光信号来识别分泌IFN-γ的功能性T细胞，并最终回收这些细胞进行TCR测序。

在技术验证阶段，研究团队使用已知的HCMV特异性TCR（如C25-TCR）转导的T细胞证明MicroFAST能够有效区分抗原特异性和非特异性反应，其检测灵敏度与传统的IFN-γ ELISPOT assay相当。更重要的是，他们成功从阳性NanoPen中回收并测序得到了正确的TCR序列。

为展示MicroFAST的实际应用价值，研究人员首先从健康供者中筛选HCMV特异性CD8⁺T细胞。通过对HLA-A*02:01限制性NLV表位特异性扩增的PBMC进行分析，他们发现尽管多聚体染色显示近80%的CD8⁺T细胞为阳性，但只有少量细胞（50/1400）在MicroFAST中显示功能性反应。从这些功能性细胞中鉴定出的Pen998-TCR经证实能够特异性识别NLV表位并介导强大的细胞因子分泌功能。

更令人印象深刻的是，研究团队还将MicroFAST应用于未知表位的筛查。从SARS-CoV-2感染康复者的PBMC出发，他们发现对N蛋白52-102肽段库的反应最强。通过MicroFAST筛选，他们获得了多个抗原特异性TCR克隆（Pen346、Pen1298、Pen369和Pen363）。随后利用表达这些TCR的J76.8报告细胞系（一种表达CD8分子和NFAT控制荧光素酶报告基因的Jurkat76细胞），研究人员逐步将表位范围缩小，最终鉴定出一个HLA-B*35:01限制性的9肽表位TPSGTWLTY（TPS）。该表位在SARS-CoV-2变异株中高度保守，且与SARS-CoV-1有较高同源性。

功能验证实验表明，这些TCR转导的原代CD8⁺T细胞在遇到特异性抗原时能够产生IFN-γ、TNF-α和CD107a等效应分子，并有效杀伤表位脉冲的靶细胞。值得注意的是，尽管Pen369-TCR对多聚体的结合亲和力最低，但其介导的功能反应却与其他高亲和力TCR相当甚至更强。

为了进一步探索TCR结合亲和力与功能性的关系，研究人员分选了HLA-B35:01/TPS Dextramer阳性的CD8⁺T细胞进行单细胞扩增和功能分析。结果发现，大多数多聚体阳性细胞在抗原刺激下并不产生IFN-γ，再次证实了单纯依靠结合亲和力筛选T细胞的局限性。对MicroFAST获得的所有HLA-B35:01/TPS特异性TCR进行的综合分析显示，TCR-p-MHC结合亲和力与T细胞功能指标（如细胞因子产生和脱颗粒能力）之间缺乏相关性。

该研究的创新性在于开发了一种功能导向的抗原特异性T细胞筛选平台，克服了传统多聚体技术的局限性。MicroFAST不仅适用于已知表位的验证，更能发现未知表位特异性T细胞，为传染病和肿瘤免疫治疗提供了强大的工具。研究结果强调基于功能而非单纯结合亲和力的T细胞筛选策略的重要性，这对开发更有效的T细胞治疗产品具有重要指导意义。

然而，研究也存在一定局限性。由于每个NanoPen中只容纳单个T细胞和少量APC，细胞间相互作用信号可能不足，导致检测灵敏度受限。此外，一次实验只能分析约1500个细胞，通量相对较低，可能遗漏某些稀有细胞群体。TCR配对获取率较低（<50%）也是需要改进的方面。

总的来说，这项研究不仅提供了一种新的技术平台，更重要的是改变了抗原特异性T细胞筛选的策略理念，为未来免疫学研究和新疗法开发奠定了重要基础。