嘧啶合成抑制剂与N4-羟基胞苷协同作用显著抑制流感病毒复制

本研究针对流感病毒耐药性问题，探讨了N4-羟基胞苷(NHC)与嘧啶合成通路抑制剂(DHODH/CTPS)的协同抗病毒机制。研究发现联合用药通过耗竭胞苷核苷酸库显著增强NHC的病毒错误植入效应，在多种流感亚型（H1N1/H3N2/H5N1）和细胞模型中均实现强效协同，动物实验证实其可缓解临床症状。该策略为扩大核苷类似物临床应用提供了新思路。

　　

流感病毒至今仍是全球健康的重要威胁，其通过抗原漂移（antigen drift）引发季节性流行，更可能通过抗原转换（antigen shift）产生全新亚型导致大流行。现有抗流感药物如神经氨酸酶抑制剂奥司他韦（Oseltamivir）和帽依赖性核酸内切酶抑制剂巴洛沙韦（Baloxavir）虽有效，但耐药毒株的频繁出现严重限制了长期疗效。N4-羟基胞苷（N4-hydroxycytidine, NHC）作为莫努匹拉韦（Molnupiravir）的活性形式，在细胞模型和动物实验中均显示出对甲型流感病毒（IAVs）的强大活性且不易产生耐药性，但其临床疗效仍有提升空间。

此前在SARS-CoV-2中的研究发现，抑制嘧啶生物合成能显著增强NHC的抗病毒活性。基于此，研究人员推测该策略或同样适用于流感病毒。为此，他们系统评估了NHC与二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase, DHODH）或胞苷三磷酸合成酶（cytidine triphosphate synthases, CTPS1/2）抑制剂联用对多种IAV亚型的抗病毒效果，并深入探究了其作用机制和宿主适应性对疗效的影响，相关成果发表于《Antiviral Research》。

研究团队运用了多种关键技术方法：在细胞水平（MDCK、Calu-3、DF-1细胞）通过病毒滴定（TCID₅₀）、qRT-PCR定量病毒RNA、免疫荧光（IF）和免疫印迹（Western Blot）评估病毒复制；采用最高单剂（HSA）模型计算协同分数；通过补充外源嘧啶核苷进行机制验证；利用位点定向突变和病毒拯救技术构建PB2-K627E突变病毒以研究宿主适应性；通过荧光素酶报告基因的微型基因组（minigenome） assay分析聚合酶活性；最后在雪貂感染模型中评估了药物的治疗效果和病理变化。

NHC与DHODH抑制剂协同抑制流感病毒复制

研究人员用NHC和多种DHODH抑制剂（BAY 2402234、特立氟胺、IMU-838）预处理MDCK细胞后感染H1N1/WSN/33病毒。结果显示，联合用药几乎完全消除了病毒导致的细胞病变效应（CPE），大幅降低了上清液中的病毒RNA量和感染性病毒颗粒滴度（降低达4个对数级），并显示出高于20的协同分数（>10即表示协同），且在此浓度下未观察到细胞毒性。

CTPS抑制剂同样能协同增强NHC的抗病毒效力

与DHODH抑制多嘧啶合成不同，CTPS抑制剂特异性阻断胞苷核苷酸合成。实验发现，CTPS抑制剂（CPEC、STP720、STP938）与NHC联用同样能有效消除CPE，强烈抑制病毒RNA释放和感染性病毒产生，且无细胞毒性。值得注意的是，特异性抑制CTPS1的STP938与抑制CTPS1/2的化合物效果相当。

协同效应在治疗性给药、多种细胞和病毒亚型中均成立

为模拟临床治疗场景，研究人员在病毒感染后才给药。结果表明，在MDCK和人源肺腺癌细胞Calu-3中，针对H1N1、H3N2等多种IAV亚型，NHC与嘧啶合成抑制剂的联合治疗均能深度抑制病毒RNA释放，其效果远优于单药治疗。

联合用药强烈降低病毒蛋白水平

免疫荧光和免疫印迹分析证实，NHC与BAY或STP720联用可显著降低感染细胞中病毒核蛋白（NP）和血凝素（HA）的表达水平，并将感染性病毒滴度抑制至检测限以下。

外源添加嘧啶核苷可逆转联合用药的抗病毒效果

为阐明机制，研究者在用药同时补充外源核苷。结果发现，添加尿苷或胞苷均可逆转DHODH抑制剂与NHC联用导致的病毒复制抑制。然而，对于CTPS抑制剂与NHC的联合，只有胞苷能有效挽救病毒复制，而尿苷无效。这强有力地证明，CTPS抑制剂是通过特异性耗竭胞苷核苷酸库来增强NHC效力的。

病毒对宿主的适应性调控NHC与嘧啶合成抑制剂的协同效应

研究发现，一些缺乏哺乳动物适应性突变（如PB2蛋白第627位为谷氨酸E，而非赖氨酸K或缬氨酸V）的禽源IAV毒株对联合治疗的敏感性较低。通过将H1N1/PR/34病毒的PB2-K627逆突变回E，研究人员发现该突变体在哺乳动物MDCK细胞中复制能力差，但在禽源DF-1细胞中复制良好。相应地，抑制剂在感染K627E病毒的MDCK细胞中效果减弱，而在DF-1细胞中效果增强。微型基因组实验进一步表明，禽源适应的聚合酶（PB2 627E）其本身活性以及对NHC的敏感性均低于哺乳动物适应的聚合酶。这表明，复制速度较慢的非适应性毒株，其NHC的作用窗口期更窄，从而限制了其与嘧啶合成抑制剂的协同效应。

NHC与STP938在雪貂模型中减轻H5N1感染临床症状

在雪貂H5N1感染模型中，于出现临床症状后开始治疗。联合用药显著减轻了感染导致的体重下降。单药或联合用药均能降低体温。NHC单药或联合治疗能显著降低鼻腔冲洗液和各组织中的病毒RNA载量，而STP938单药效果不明显。组织病理学分析显示，所有治疗均能防止中枢神经系统坏死和病毒抗原检出。值得注意的是，STP938治疗（单药或联合）抑制了针对病毒NP的抗体反应，提示CTPS抑制可能具有免疫抑制效应。联合治疗虽未在病毒载量上显示出统计学上的显著协同，但改善了临床结局。

本研究结论指出，药理抑制嘧啶合成能协同增强NHC对多种IAV的抗病毒活性，其核心机制在于内源性胞苷核苷酸的耗竭迫使病毒聚合酶更多地误 incorporation NHC，最终导致病毒基因组的错误灾难（error catastrophe）。该协同策略具有广谱性，但其效果受到病毒聚合酶与宿主因子ANP32A互作所介导的宿主适应性的调节。

讨论部分强调了该发现的潜在临床意义和转化前景。DHODH和CTPS是可行的药物靶点。相较于DHODH抑制，CTPS抑制因其特异性更强且不易被血清中存在的尿苷逆转，可能更具临床优势。然而，研究也指出了几个重要考量：首先，NHC本身是一种诱变剂，不完全的病毒抑制可能加速逃逸突变体的产生，因此需要足量给药以彻底清除病毒。其次，嘧啶合成抑制剂已知具有免疫抑制作用，本研究中STP938对体液免疫的抑制也证实了这一点，这在减轻炎症反应方面可能有益，但也可能损害长期免疫记忆的建立，提示治疗后需考虑接种疫苗。最后，对非适应性毒株效果的减弱反映的是其本身复制能力弱，而非联合疗法的根本局限，因为这些毒株本身致病性就低。

综上所述，这项研究不仅证实了靶向宿主嘧啶代谢以增强核苷类似物抗病毒效果的普适性策略，为流感的临床治疗，特别是应对可能由新亚型引发的大流行提供了新的联合用药方案，也为拓展其他病毒（如使用其他嘧啶类似物的HIV、HBV等）的治疗策略提供了思路。