综述：利用原子探针层析成像技术探测近原子尺度硬质生物材料结构的综述

本综述系统阐述了原子探针层析技术（APT）在硬质生物材料研究中的突破性应用。文章详细介绍了APT凭借其近原子级分辨率、三维化学成分分析能力和ppm级痕量元素检测优势（特别是对骨、牙等生物矿物中Mg2+、Na+等关键离子的精准定位），如何揭示生物材料中有机-无机界面的化学结构特征。同时深入探讨了针对非导电生物材料的激光脉冲模式、聚焦离子束（FIB）制备等关键技术挑战与解决方案，为生物医学领域提供了前所未有的原子尺度洞察力。

　　

开启生物材料的原子级探索新时代

原子探针层析技术（Atom Probe Tomography, APT）正以前所未有的精度揭开生物材料的神秘面纱。这种强大的分析技术能够实现物质原子级的三维重建，提供涵盖整个元素周期表的定量三维元素和同位素分析，其化学灵敏度、空间分辨率和三维成分重建能力具有独特优势。虽然APT最初应用于冶金学领域，但近年来已扩展到半导体、地质学和生物学等多个新学科，这主要归功于激光诱导蒸发技术使研究导电性较差的材料成为可能。

技术原理与独特优势

APT的工作原理基于场蒸发现象：在针尖状样品顶端施加高强度电场（数量级为几至几十V/nm），通过激光或电压脉冲触发原子从样品表面电离和解吸。被场蒸发的离子通过飞行时间质谱仪进行检测，其质量-电荷比（m/q）被转换为质谱图。理想情况下，APT可实现0.06 nm的深度分辨率和0.15 nm的横向分辨率。

APT在硬质生物材料研究中展现出四大核心优势：

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  近原子级空间分辨率，能够检查骨和牙等生物组织的精细结构和组成
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  详细的化学成分分析能力，可分析组织内的元素分布情况
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  三维成像功能，提供纳米尺度相的内部排列的全面视图
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  痕量元素识别能力，检测限可达百万分之一（ppm）级别

关键技术突破

研究非导电样品如生物材料之所以成为可能，主要依靠两项技术突破：激光脉冲原子探针技术和原位位点特异性聚焦离子束（Focused Ion Beam, FIB）提取工作流程。

激光模式APT克服了传统电压脉冲模式对材料电导率的限制。虽然早在1980年代就有研究证明可以用激光脉冲分析材料，但直到2005年第一批商业激光原子探针问世，激光模式才真正被广泛应用于绝缘材料研究。

FIB提取技术则彻底改变了APT样品制备方式。通过使用微操纵器提取样品碎片并将其附着到FIB内的样品接收器上，研究人员能够制备出针尖状的APT样品。对于光束敏感的非导电生物材料，通常需要采用低成像电压（≤3 kV）和电流（≤500 pA）的扫描电子显微镜（SEM）以及低加速电压（≤2 kV）和电流（≤200 pA）的聚焦离子束，以防止环形铣削最终阶段的针尖弯曲。

硬质生物材料的原子级洞察

骨组织研究

2017年，Langelier等人首次报道了通过APT确定的骨组织结构研究。他们的研究揭示了局部梯度、Mg的痕量水平检测以及Na在矿物和胶原域界面的共定位，强调了Na富集界面在连接矿物和胶原结构中的重要性。随后在2021年，Lee等人利用APT更深入地研究了骨组织的胶原纤维，提供了纳米级胶原-矿物排列的详细3D可视化。

Holmes等人在2023年首次分析了在生物陶瓷支架内形成的骨的原子尺度结构。研究发现新形成的骨组织组成与成熟皮质骨组织不同，并且从降解的生物陶瓷植入物中释放的元素（特别是Al）在新骨和成熟骨组织中均可检测到。

牙釉质与象牙质

2012年，Gordon等人首次使用APT研究了象牙牙本质。他们发现APT质谱与合成羟基磷灰石（HAP）相似，另外还检测到Na⁺（0.25-0.6 at.%）和Mg²⁺（0.5-1.7 at.%）。Gordon团队在2015年完成了对小鼠门牙牙釉质的全面研究，显示在未着色的啮齿动物牙釉质（内釉质）中，Mg²⁺主要作为镁取代的无定形磷酸钙（Mg-ACP）的晶间相存在于晶界处。

La Fontaine等人在2016年使用APT首次直接观察到了成熟人牙釉质中羟基磷灰石纳米线之间的富镁无定形磷酸钙（ACP）相。这一发现具有重要意义，因为Mg²⁺离子通过稳定其前体ACP来调节HAP结晶，但Mg²⁺离子在HAP内的原子尺度分布一直未知。

氟化物处理与疾病研究

DeRocher等人使用原子探针研究了氟化物处理的牙齿，显示氟化物会进入晶界。APT研究表明，氟化增加了晶间相中F和Na的浓度，这是由于短路扩散造成的。Houari等人研究了牙釉质发育缺陷，包括磨牙切牙釉质矿化不全（MIH）和牙氟中毒（DF）。APT允许在纳米尺度上分析F^-、Na⁺、Mg²⁺和COH/C的空间分布。

海洋生物矿物与蛋白质研究

海洋生物矿物

2011年，Gordon等人首次使用APT研究了石鳖牙齿（海洋软体动物Chaetopleura apiculate）。作者注意到几丁质特征原子和分子离子（N⁺、N²⁺、C⁺、C²⁺、CO⁺、CO₂⁺）存在于石鳖牙齿纤维中，但在周围的磁铁矿中不存在。

Eder和Otter在2019年首次进行了珍珠母（nacre）的原子探针研究，重点研究了地中海贻贝Mytilus galloprovincialis。通过将水产养殖中的Sr脉冲追踪标记实验与微观（通过NanoSIMS）到亚纳米尺度（通过原子探针）的相关分析相结合，作者表明珍珠母通过一个动态的两步过程生长，涉及扩展和填隙生长阶段。

蛋白质研究

蛋白质作为由氨基酸组成的组织结构成分，太小而无法直接观察。为了确定其原子分辨率的三维结构，大蛋白质必须结晶并通过X射线衍射进行分析，而溶液中较小蛋白质的结构可以通过核磁共振（NMR）分析来研究。

2016年，Perea等人将铁蛋白嵌入树脂中，并使用APT揭示了P的原子分布，从而深入了解了P在稳定水铁矿中的假定作用。选择铁蛋白分子的原因是，蛋白质的场蒸发可以通过APT质谱中Fe的检测来确认，因为水铁矿核心是富铁的（水合氧化铁（III））。

2020年，Qiu等人在没有低温传输的情况下用APT对冷冻水合状态的铁蛋白进行了成像。作者使用石墨烯封装将溶液中的铁蛋白固定在金属样品针上。石墨烯因其卓越的导电性和机械性能，能够有效地"伪装"脆弱的生物样品以进行APT成像。

细胞与化石组织研究

脱水细胞研究

像蛋白质一样，细胞必须经过精心选择的制备条件才能转换为适合APT分析的状态，例如脱水、化学固定、低温冷冻或嵌入树脂中。考虑到细胞结构相对于原子探针针尖样品的几何尺寸也很重要。

2012年，Narayan等人首次通过原子探针层析技术研究了哺乳动物HeLa细胞（冷冻干燥）。采用冷冻干燥方案，将样品在液氮温度下快速 plunge冷冻，不使用固定剂或染料，然后在高真空条件下缓慢恢复到室温。这使得细胞能够温和脱水，而不会引起其化学组成和结构的大规模扰动。

2016年，Adineh等人通过原子探针层析技术研究了超级细菌Acinetobacter baumannii细菌细胞。对多粘菌素B敏感（ATCC 19606S）和耐药（ATCC 19,606 R）的A. baumannii菌落进行了研究。在电压脉冲模式下记录了包含1-2百万个离子的APT数据集，在重建的敏感和耐药菌株细胞内区域的3D体积中观察到长结构特征，宽度为5-10 nm，以H、C、N、O、CO和COH峰为特征。这些长结构特征很可能起源于细胞内囊泡的膜。

化石组织研究

2024年，Gao等人首次报道了使用原子探针层析技术分析化石组织。作者将APT应用于无机磷灰石（Durango磷灰石）和化石牙形石磷灰石，旨在检测化石牙形石中的残留有机成分。他们的发现强化了C-N耦合信号作为区分生物矿物与其无机对应物的化学标志的重要性，与Pérez-Huerta等人的工作一致。

实验条件与样品制备挑战

测量条件优化

硬质生物材料的原子探针研究需要比传统材料（如钢和合金）更温和的运行条件。研究表明，不同的生物材料类型需要不同的仪器设置参数，包括激光脉冲波长、激光能量、脉冲频率、检测率和温度等。例如，人骨研究通常使用355 nm激光波长，75 pJ激光能量，160 kHz脉冲频率，0.5%检测率和43 K温度，可获得3000万以上的离子击中数。

样品制备工作流程

用于硬质生物材料的FIB制备APT针尖样品已建立的工作流程有几个共同点。首先，在装入FIB-SEM仪器之前，必须用导电材料（如Au或Pt）的薄层（5-10 nm）溅射涂覆样品表面，以避免在高能量束下充电。必须选择合适导电的柱作为FIB提取样品的基板，例如电抛光钼半格、电抛光钨半格或CAMECA商业化的掺杂硅柱微阵列。

将样品楔焊接到每个APT柱上的尺寸很重要。针尖顶端与导电柱的Pt焊点之间的长度尺寸为5-9 μm是合适的，以避免柱材料的次级针尖暴露于原子探针激光并因此优先场蒸发。Pt焊点处的样品直径约为2 μm以确保稳定性，最大限度地减少断裂的机会。

材料特异性挑战与解决方案

硬质生物材料对原子探针层析技术提出了几个材料特异性挑战，包括FIB提取过程中绝缘区域的充电、样品有机和无机区域之间 largely不同的蒸发场、复杂离子的形成、潜在峰重叠（同量异位素重叠）、高热尾和在高电压条件下原子探针针尖样品的频繁断裂。

同量异位素峰重叠对于具有复杂组成的材料是一个报告的挑战。同量异位素重叠是指两种不同元素的同位素导致相同质量-电荷比的峰。例如，锌尖晶石玻璃陶瓷APT质谱中的32 Da峰被归因于⁶⁴Zn²⁺和^16,16O₂¹⁺。在某些情况下，这些挑战可以使用原子探针分析软件中的峰反卷积程序来解决，例如CAMECA的AP Suite包。

原子探针质谱中的热尾可能发生在硬质生物材料中，是由于样品在激光脉冲加热后冷却过程中发生场蒸发造成的。热尾表现为APT质谱中离子峰后的高基线。热尾的存在是因为并非所有离子都在激光脉冲的确切时间蒸发，一小部分离子在激光脉冲后继续蒸发一段时间，随着样品冷却，贡献到主峰后面的尾翼。

与其他技术的比较优势

与互补技术相比，APT具有独特的优势和局限性。透射电子显微镜（TEM/STEM）虽然能提供原子空间分辨率和晶体取向映射，但化学对比度有限且存在束损伤问题。纳米二次离子质谱（NanoSIMS）能进行同位素分析且分析区域较大，但空间分辨率较低（50 nm）且仅限于表面分析。X射线衍射（XRD）可用于晶体相鉴定和批量分析，但无法提供空间分辨率。

APT的独特优势在于其三维元素映射能力、近原子级空间分辨率、能同时测量周期表中的所有元素、定量痕量元素检测、界面的定量成分分析以及仅需要最小（微米级）样品体积。这些特点使APT成为研究生物材料中有机-无机界面的理想工具。

未来展望与应用前景

生物控制过程形成的生物矿物是独特的材料，其整体结构和形成途径尚未得到很好的理解，APT在这一领域提供了巨大的潜力。原子探针区别于其他显微镜技术的是它提供具有纳米级空间分辨率的三维化学成像能力。原子探针有效地结合了点投影显微镜和飞行时间质谱仪，并在近几十年来发展成为一种宝贵的表征技术，能够提供材料的近原子尺度三维表征，对所有元素具有同等的灵敏度。

原子探针的局限性包括通常无法识别晶体结构（除一些例外情况）以及与S/TEM样品相比相对较小的视场（约100×100×300 nm³）。因此广泛认为，根据研究目标，APT应与其他结构表征技术如S/TEM、NMR和NanoSIMS相辅相成，以实现对材料和生物组织中结构-性能关系在多长度尺度上的全面理解。

对于骨组织和骨组织再生的生物陶瓷支架，原子探针研究提供的见解使研究人员能够增强对支架如何与周围组织相互作用的理解，促进生物医学植入物设计和性能的未来迭代改进。最终，这些知识旨在减少并发症和/或失败，同时加速组织形成速率。未来，将原子探针研究扩展到病变骨组织为检测局部区域中的结构变化（空间排列变化）和化学变化（如离子缺陷）提供了机会。

需要转换为硬质材料形式以便用原子探针研究的软生物材料，即整个冷冻水合细胞（还需要低温制备和传输）、蛋白质和酶，已经引起了领先国际研究团队的日益增长的兴趣。我们可以期待在下一个十年中在这一学科看到更多激动人心的突破。