基于PNIPAM-AANBD荧光聚合物温度计的斑马鱼胚胎及幼虫线粒体实时测温研究

本刊推荐：本研究创新性开发了线粒体靶向荧光聚合物温度计PNIPAM-AANBD，通过哌嗪环氢键作用与烷基链疏水性修饰实现精准靶向，在24.0–44.0°C生理温区呈现显著荧光增强效应。成功应用于斑马鱼胚胎/幼虫模型，证实其在发热抑制和解热剂应答中可动态监测线粒体温度波动（胚胎荧光强度变化25%-69%，幼虫30%-49%），为线粒体功能相关生理病理研究提供了高时空分辨率技术平台。

　　

Highlight

作为真核细胞的能量工厂，线粒体表现出温度调节波动性，使其成为评估细胞功能完整性与代谢状态的关键生物传感器。然而，线粒体的亚细胞区室化与纳米级尺寸对时空分辨热计量分析构成重大技术挑战，尤其在胚胎和体内微环境中。本研究开发了荧光聚合物温度计PNIPAM-AANBD，其设计包含可与特定线粒体分子形成氢键的哌嗪环，以及增强脂溶性的烷基侧链。这种双功能设计实现了对线粒体的精准靶向。值得注意的是，PNIPAM-AANBD在24.0–44.0°C生理相关温度范围内表现出显著的热响应性荧光增强。凭借该探针卓越的时空分辨率与线粒体热特异性，我们建立了斑马鱼胚胎与幼虫模型以验证其可行性。在发热诱导实验中，相较于对照组，斑马鱼胚胎平均荧光强度增加25%，幼虫增加49%；而在解热实验中，胚胎荧光强度随解热剂浓度梯度下降46%–69%，幼虫因不同解热剂（京尼平与安替比林）下降30%–36%。

Materials and instruments

N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、二氯甲烷、2-甲基-2-[(十二烷基硫代羰基)硫代]丙酸(DDAT)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、丙烯酰氯购自Meryer（中国上海）；4-氯-7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(PZ-NBD)、2,2-偶氮二异丁腈(AIBN)、1,4-二氧六环、京尼平购自MREDA（中国北京）；MitoTracker? Deep Red FM由上海源叶生物科技有限公司提供；羰基氰化物

Preparation and Characterization of PNIPAM–AANBD

方案1展示了该荧光聚合物温度计的构成：包含温敏组分PNIPAM与荧光信号报告单元AANBD，用于监测线粒体温度。采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合法制备PNIPAM–AANBD，通过系统参数优化研究确立了温敏聚合物单体NIPAM与荧光染料AANBD的理想浓度。

Conclusion

总之，我们开发了荧光聚合物温度计PNIPAM-AANBD，其通过哌嗪环与特定线粒体分子的氢键作用及增强脂溶性的烷基侧链实现精准线粒体靶向。该探针在24.0–44.0°C生理温区呈现显著热响应性荧光增强。凭借其卓越性能，我们建立了斑马鱼胚胎与幼虫模型验证其有效性。该温度计为体外与体内线粒体温度纵向监测提供了简单有效的方法，有助于阐明线粒体功能相关的核心生理与病理机制。