综述：畜禽粪便堆肥过程中抗生素抗性基因的动态与减控：全面综述

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Dynamics and mitigation of antibiotic resistance genes during manure composting: A comprehensive review

本综述系统阐述了畜禽粪便堆肥过程中抗生素抗性基因（ARGs）的动态变化、关键影响因素（温度、pH、C/N比等）及多种新型减控策略（超高温堆肥、生物炭添加、电场/磁场辅助等），为优化堆肥工艺以阻断ARGs环境传播、保障公共健康提供了重要理论依据和技术参考。

　　

2. 抗生素抗性基因与堆肥过程

3.1. 堆肥阶段

堆肥过程经历四个典型阶段：中温阶段、高温阶段、降温阶段和腐熟阶段。每个阶段具有独特的温度动态、微生物群落和理化特性，并差异性地影响ARGs的行为。

中温阶段启动分解过程，温度通常在20–40°C，由嗜中温的细菌、真菌和酵母驱动。高温阶段温度可达45–70°C，嗜热微生物如芽孢杆菌属（Bacillus）和嗜热丝菌属（Thermomyces）加速有机物降解和ARGs去除，其特点是微生物演替、氮素损失、pH值上升以及MGEs减少。降温阶段温度回落至30–50°C，嗜中温微生物和真菌（如毛壳科真菌Chaetomiaceae和子囊菌门Ascomycota）重新繁殖，继续分解纤维素和木质素。腐熟阶段温度低于30°C，完成堆肥稳定化，有机物转化为腐殖质，C/N比进一步降低至稳定水平。

3.2. 粪便中的ARGs类型

畜禽粪便是ARGs的重要储存库。常见类型包括：四环素类抗性基因（如tetW, tetO, tetM, tetQ），常见于猪粪和鸡粪；大环内酯类抗性基因（如ermB, ermF），常见于鸡粪和猪粪；磺胺类抗性基因（如sul1, sul2, sul3），在各种粪便中普遍存在；β-内酰胺酶基因（如blaTEM, blaCTX-M），在牛粪中显著存在。其他如floR, catB3, aac(6′)-Ib也具有重要意义。MGEs（包括质粒、整合子和转座子）在ARGs的环境传播中扮演关键角色。

4. 堆肥过程中ARGs的动态变化

4.1. 理化参数的影响

温度、pH、水分含量和氧气水平等理化参数对ARGs动态至关重要。

高温，尤其是在嗜热阶段，通过热灭活抗性细菌（ARBs）和ARGs在减少ARGs方面发挥重要作用。超高温堆肥可实现高达89%的ARG和MGE去除率。延长高温持续时间能显著增强去除效果并抑制反弹。

pH影响微生物组成和ARGs动态；碱性条件（pH > 7）通常与ARGs减少有关。酸性pH（<6.5）可能通过耐酸宿主（如放线菌Actinobacteria）促进ARGs持久存在。然而，最佳的ARG减少通常发生在近中性至弱碱性pH（～7.5）。

最佳水分含量在40–60%之间支持微生物降解ARGs；过多水分可能导致厌氧条件和ARGs增殖。水分的作用与温度等其他参数的相互作用而复杂化。

高氧水平促进有效降解有机物和ARGs的好氧微生物生长，从而减少HGT。低氧促进厌氧ARG宿主细菌（如梭菌Clostridia）的持久存在，增加ARG持久性。

高C/N比通过促进竞争性微生物来减少ARGs。低C/N比导致氨积累，抑制微生物活性，促进ARGs持久存在。平衡的C/N比对于微生物效率和最小化ARGs存活是必要的。

4.2. 微生物和遗传因素的作用

微生物和遗传因素对堆肥过程中ARGs的命运和动态至关重要。

不同堆肥阶段的微生物演替驱动了ARG的变化。高温条件促进诸如芽孢杆菌属（Bacillus）、梭菌属（Clostridium）和嗜热单孢菌属（Thermomonospora）等细菌，有助于有机物分解并影响ARG谱。在冷却阶段，假单胞菌属（Pseudomonas）和 Lysinibacillus 占主导地位，进一步促进ARG转化和宿主转移。

优势门类，如厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria），既是有机物降解的作用者，也是ARGs的储存库。厚壁菌门在高温期丰富，通过抗生素修饰酶和外排泵减少ARGs。放线菌门在高温和腐熟阶段有助于有机物和抗生素的降解，从而帮助减少ARGs。变形菌门在早期阶段占主导，参与有机物的早期分解，并与 tet 和 sul 抗性类型的基因的HGT有关。

MGEs，包括质粒、转座子和整合子，是ARG传播的关键载体，尤其是在腐熟阶段。高水平整合子基因（intI1, IS6100）表明即使在堆肥稳定化过程中，ARG的移动性仍在持续。高风险ARGs（如tetW, aadA, sul2）的持久存在通常与MGEs有关，并由整个堆肥过程中的优势细菌宿主携带。

高温使质粒不稳定并减少ARGs的移动性，而抗生素残留则增强HGT和MGE的活性。HGT机制，包括接合、转化和转导，是堆肥系统中ARG传播的主要途径。细菌噬菌体，特别是Caudovirales目，介导转导并促进细菌间的ARG交换。HGT由多种因素驱动，如细菌应激反应、环境因素、群体感应和MGEs的存在。尽管通过堆肥总体上减少了ARG，但HGT有时会维持和传播ARGs，可能导致在腐熟阶段ARG反弹。

5. 增强ARG去除的技术与管理方法

5.1. 堆肥技术、共堆肥材料和添加剂

目前已开发出多种堆肥策略来增强有机废物中ARGs和MGEs的去除。

基于热的方法，如嗜热和超高温堆肥以及热预处理，始终表现出高ARG去除效率。连续嗜热堆肥（CTC）比正常嗜热堆肥（NTC）表现更优。超高温堆肥可实现高去除率，但堆肥后ARGs反弹的现象也有观察，突显了需要长期稳定策略。

物理增强技术，如覆膜堆肥（smTC），优于传统设置。电动增强堆肥通过微生物结构转变实现ARG减少。磁场增强堆肥可去除高达100%的ARGs，并减少整合子和插入序列。

添加剂如生物炭、水热炭和纳米零价铁（nZVI）也在ARG减控中发挥关键作用。添加生物炭与超高温堆肥可改善ARG去除。相反，玉米秸秆生物炭抑制了intI1并增强了抗生素降解。虾壳生物炭显著降低了 tetW 和 ermX 水平。水热炭在鸡粪堆肥中减少了 intI1, IS6100, 和 IS26。nZVI在猪粪堆肥中大幅减少了细胞内和细胞外ARGs。然而，铜在与污水污泥和发酵残渣共堆肥时，尽管能有效降解泰乐菌素，但在较高浓度下会促进ARG增殖。

蚯蚓堆肥和添加生物炭的蚯蚓堆肥结果多变。微生物接种剂效果不一；腐熟堆肥接种物去除了大部分ARGs和MGEs，而复合接种剂尽管减少了ARGs却增加了intI1。自制接种剂增强了抗生素降解，但由于微生物富集，增加了 tetA 和 sul1。

堆肥材料的类型也起着关键作用。猪粪堆肥实现了ARG减少，而餐厨垃圾则增加了ARGs和磺胺类基因。这些发现强调堆肥效率取决于堆肥技术、添加剂和原料，它们共同影响ARG的持久性或抑制。

5.2. 抗生素残留和重金属的影响

抗生素残留与其他药物和重金属的存在产生了选择性压力，促进堆肥过程中抗生素耐药微生物（ARGs和MGEs）的增殖。

畜禽养殖中高达90%的抗生素以未代谢形式排出，导致堆肥中四环素类、磺胺类和大环内酯类残留水平高，这与它们在堆肥中的频繁检测相关。这些残留不仅促进ARGs的持久存在，还通过MGEs增强HGT。高残留导致较低的ARG去除率。生物炭以其高比表面积可以吸附抗生素，而微生物接种剂如芽孢杆菌属（Bacillus spp.）可酶解降解四环素类。然而，抗生素残留减少并不总是等同于ARG抑制，表明它只是影响ARG动态的因素之一。

重金属作为堆肥过程中ARGs的持久共选择剂。重金属对细菌有毒，会刺激环境胁迫，导致与金属抗性基因（MRGs）相关的ARGs或MGEs的共选择或维持。生物可利用量的Cu和Zn显著富集了 sul1, tetM, 和 ermB，并与 intI1 强烈相关。甚至猪粪中正常背景水平的Cu和Zn也维持了 sul1 和 tetW 的持久存在。在牛粪蚯蚓堆肥中添加砷增加了总体ARG丰度和 intI1 水平。猪粪堆肥中铬的补充同样改变了ARG和MGE的动态。这些发现共同表明，重金属通过富集和MGE介导的转移增强了ARG的持久性。针对重金属减少或去除的技术也可促进堆肥过程中的ARG减控。

6. 堆肥中ARGs的环境与健康影响

6.1. 堆肥改良土壤中的ARGs

堆肥施用于土壤可提高肥力，但也可能引入残留的ARGs，引发环境担忧。

虽然堆肥与原始粪便相比减少了ARGs，但一些基因在施用后仍然存在并可转移。堆肥改良的土壤其ARG水平比使用矿物肥料的土壤高，同时MGE显著富集，表明存在持续的HGT潜力。宏基因组分析证实，堆肥衍生的ARGs，特别是四环素类、大环内酯类和氨基糖苷类抗性基因，在土壤中仍可检测到，尽管水平低于未处理的粪便。土壤ARG的持久性取决于微生物生态学、MGE流行率和土壤特性。堆肥改良的土壤也表现出比对照组更高的ARG多样性，表明堆肥可减轻但不能消除ARG传播。

还存在ARGs渗入地下水或被作物吸收的担忧。ARGs随土壤深度增加而下降，但在深层仍可检测到，暗示潜在的地下水污染。此外，尽管证据有限，研究表明可食用作物可能从土壤中吸收ARBs，对食品安全构成风险。未来的研究应优先进行长期田间研究，以量化ARG淋溶和作物吸收，并开发专门针对MGEs的堆肥处理方法以破坏HGT途径。

6.2. 对人和动物健康的潜在风险

ARGs从堆肥改良的土壤向人类和动物病原体的转移构成了多方面的威胁，农业生态系统中耐药性决定子的普遍存在加剧了这一威胁。

研究发现了土壤-蔬菜连续体中持久存在的载体，突出了其向临床相关抗生素传播耐药性的潜力。在堆肥处理的土壤中鉴定出的病原体，这些属携带毒力因子和ARGs，引发了它们可能定殖作物或将耐药性转移给临床病原体的担忧。

人类暴露途径包括摄入受污染的作物、吸入土壤尘埃以及接触灌溉水，蔬菜是ARB或ARG进入食物链的直接渠道。虽然烹饪可能减少病原体负荷，但生食受污染的蔬菜可能促进ARGs向肠道微生物组的转移。猪粪堆肥的应用增加了小白菜叶片中的链球菌属（Streptococcus）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae），它们是ARG进入食物链的潜在载体。此外，牲畜或儿童摄入土壤会将ARGs引入新宿主，在那里它们可能整合到常驻微生物群落中。

7. 未来研究方向与局限性

尽管关于堆肥过程中ARG动态的研究不断增长，但几个局限性仍然存在。大多数研究是在实验室规模条件下进行的，参数不一致，限制了研究结果在现实世界应用中的普遍性。缺乏标准化和统一的ARGs和MGEs定量方法，使得跨研究比较困难。田间验证仍然有限，特别是在堆肥施用后土壤中ARGs的长期持久性和再现性方面。堆肥期间和之后水平基因转移的机制和程度也了解甚少。此外，粪便中的残留抗生素可能在堆肥期间继续施加选择压力， potentially promoting the development of resistant strains. 许多研究集中在四环素和磺胺类抗性基因上，对其他类别以及与重金属或杀菌剂的共选择关注较少。

为弥补这些空白，未来研究应优先关注以下领域：采用多组学方法（如宏基因组学、转录组学、蛋白质组学）的机制研究；优化堆肥技术，包括添加剂组合、温度曲线和通气策略；将堆肥与新兴技术（如噬菌体疗法、基于CRISPR的基因编辑或电化学处理）相结合；评估堆肥改良土壤中ARGs命运的纵向研究；利用机器学习和建模工具；最后，建立政策框架和风险评估协议。

8. 结论

堆肥已成为减轻粪便中ARGs的一种有前景的策略，提供了环境和公共卫生益处。

本综述强调，堆肥显著减少了各种ARGs的丰度，主要通过温度升高、微生物群落转变和MGEs抑制。几个因素影响堆肥过程中ARG减少的效率：高温条件在减少病原菌和携带ARG的微生物方面起关键作用；微生物群落动态的变化，特别是有益细菌属的增加，有助于ARG减控；使用添加剂如生物炭、nZVI和腐熟堆肥接种物显著增强了ARG去除。操作策略如超高温堆肥、电动增强堆肥和磁场应用提高了ARG降解效率。

将堆肥纳入 livestock waste management systems 减少了ARGs的传播，并改善了土壤肥力和碳封存，与可持续农业实践和循环经济目标保持一致。总之，堆肥代表了一种实用、可扩展且环境友好的管理粪便相关ARG风险的方法。然而，其有效性因操作条件、原料组成和MGEs的存在而异，这需要进一步探索和优化。