广西莪术源纳米囊泡通过多细胞互促（Crosstalk）增强牙周组织再生功能：机制与治疗潜力

本研究创新性地揭示广西莪术源纳米囊泡（CKNV）通过调控牙周膜干细胞（PDLSCs）增殖迁移、诱导巨噬细胞M2型极化、促进血管生成（Angiogenesis）和成骨分化（Osteogenesis）等多通路协同作用，为牙周炎靶向治疗提供新型多模态策略。

　　

Highlight

植物源性纳米囊泡展现出卓越的生物相容性与多功能性，在组织再生领域极具应用前景。本研究聚焦于广西莪术源纳米囊泡（CKNV）在牙周修复中的再生潜力。通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析和分光光度技术，我们系统评估了CKNV的形态、粒径、表面电荷及生物活性成分。体外实验进一步揭示CKNV与牙周膜干细胞（PDLSCs）、巨噬细胞和血管内皮细胞（HVECs）间的相互作用。结果表明，CKNV在10–50?μg/mL浓度范围内以剂量依赖方式显著促进PDLSCs的增殖与迁移。此外，CKNV可诱导巨噬细胞向M2表型极化。更值得注意的是，CKNV诱导的M2型巨噬细胞能够进一步刺激HVECs的血管生成过程，并协同促进PDLSCs的成骨分化。我们的发现表明，CKNV通过多通路协同机制调控牙周组织再生：包括激活牙周膜干细胞、极化巨噬细胞向促修复M2表型转化、促进血管生成及加速成骨分化。这一发现为开发牙周炎的靶向治疗策略提供了新思路。

Discussion

通过系列体外实验，我们系统评估了CKNV在牙周组织修复中的再生潜力。研究涵盖CKNV的分离与表征、细胞摄取效率评估，以及其对牙周再生关键细胞类型的功能调控分析。这些结果深刻揭示了食物源纳米颗粒通过调控细胞间相互作用以促进组织修复的机制。

CKNV通过差速离心结合密度梯度纯化技术成功分离（图2A）。透射电镜显示其典型杯状囊泡形态（图2B），纳米颗粒追踪分析确认其流体动力学平均粒径为78.75 ± 3.2 nm（图2C）。该颗粒在PBS（pH 7.4）中呈现带负电表面，Zeta电位为-23.4 ± 1.7 mV（图2D）。进一步通过BCA试剂盒测定蛋白质浓度，并使用紫外分光光度计在280 nm处检测蛋白质吸收峰（图2E）。Western blot结果显示CKNV表达经典外泌体标志物CD63和TSG101（图2F），证实其囊泡特性。

为探究细胞对CKNV的摄取机制，我们分别用PKH26红色荧光染料标记CKNV，并与PDLSCs共培养。共聚焦显微镜图像显示CKNV可被细胞内化（图3A），且摄取过程具有浓度与时间依赖性（图3B-C）。使用细胞膜抑制剂（甲基-β-环糊精）、网格蛋白抑制剂（氯丙嗪）和小窝蛋白抑制剂（菲波莫星A1）预处理细胞后，CKNV内化显著受阻（图3D），表明其摄取依赖小窝蛋白和网格蛋白介导的内吞途径。

在功能层面，CCK-8实验显示CKNV处理显著提升PDLSCs增殖活性（图4A）。划痕实验进一步证明CKNV以剂量依赖方式促进细胞迁移（图4B-C）。此外，通过qRT-PCR和流式细胞术检测巨噬细胞表型标志物，发现CKNV处理显著上调M2型标志物Arg1和CD206的表达，同时下调M1型标志物iNOS和CD86（图5A-D），表明CKNV可诱导巨噬细胞向M2表型极化。

更引人注目的是，Transwell共培养实验表明，经CKNV处理的M2型巨噬细胞可显著增强HVECs的成管能力（图6A-B），并同步促进PDLSCs的碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨相关基因（Runx2、OCN）表达（图7A-C）。这些结果强烈提示CKNV通过调控免疫微环境与干细胞–内皮细胞互作，协同推动血管生成–成骨耦合过程。

Conclusion

本研究证明CKNV通过调控关键细胞间相互作用显著促进牙周组织再生。具体而言，这类纳米囊泡可增强PDLSCs的增殖与迁移能力，诱导巨噬细胞M2极化，并通过细胞间信号传递促进血管生成与成骨进程。这些发现突显了食用植物源纳米颗粒作为牙周疾病治疗工具的潜力。未来研究应着眼于在动物模型中验证这些效应，并深入探索其分子机制与临床转化可行性。