新生儿小鼠模型中新型O1血清群霍乱弧菌谱系诱导的炎症反应及其免疫机制研究

本文聚焦于新型O1血清群霍乱弧菌谱系（含ctxAB+株VC6050与ctxAB-株VC6055）在新生儿小鼠肠道中引发的炎症反应，通过RNA测序（RNA-seq）和病理学分析，揭示其与第七 pandemic 株N16961的差异基因表达谱（如CCL7、CXCL10等炎症因子下调），证实CTX阳性株通过上调防御素（Defa）和炎症通路（IL-17、NF-κB）增强宿主抗菌反应，为霍乱弧菌致病机制和免疫调控提供新见解。

　　

引言

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是一种重要的人类肠道病原体，其O1和O139血清群因携带编码霍乱毒素（CT）的CTXΦ噬菌体而与全球大流行霍乱相关。近年来，中国发现了一种新型O1血清群El Tor霍乱弧菌谱系，该谱系在遗传上区别于引起第七次大流行的菌株，并与渤海湾周边地区的腹泻疫情相关。霍乱毒素（由ctxAB基因编码）是霍乱典型症状——严重分泌性腹泻的主要毒力因子，但缺乏ctxAB基因的非产毒株仍可导致炎症性肠结肠炎和散发性腹泻。尽管霍乱通常被认为是一种非炎症性分泌性疾病，但在感染急性期可观察到先天免疫反应。本研究利用成年BALB/c小鼠和C57BL/6乳鼠，探究了新型谱系菌株（包括产毒株VC6050和非产毒株VC6055）以及第七次大流行代表株N16961感染后肠道先天免疫反应的特征。

材料与方法

研究使用5-6日龄C57BL/6乳鼠和6-8周龄雌性BALB/c小鼠，在ABSL-2实验室SPF条件下饲养。实验菌株包括第七次大流行株N16961（ctxAB⁺）和新型谱系菌株VC6050（ctxAB⁺）、VC6055（ctxAB^-）。乳鼠通过灌胃接种10⁸ CFU菌液或PBS对照，24小时后收集小肠组织用于细菌定植量测定、组织病理学分析和RNA提取。组织病理学评分基于炎症反应、病变深度、隐窝破坏和病变范围综合计算。RNA测序使用Illumina平台进行，差异表达基因（DEGs）筛选标准为|log2FC| ≥ 1且FDR ≤ 0.05，并通过GO和KEGG富集分析揭示生物学通路。蛋白-蛋白互作（PPI）网络利用STRING数据库和Cytoscape构建。此外，通过RT-qPCR验证转录组数据，并使用CBA试剂盒检测成年小鼠血清细胞因子水平。

结果

三种霍乱弧菌菌株在新生儿小鼠肠道中的差异定植及相似组织病理学影响

感染24小时后，VC6050和N16961组的肠道定植能力显著高于VC6055组，而VC6050与N16961组间无显著差异。组织病理学检查显示，所有感染组均出现轻度结构异常，主要表现为黏膜肌层少量炎症细胞浸润（红色箭头指示），但各组间病理评分无显著差异。PBS对照组肠道结构基本正常。

RNA测序分析

与PBS对照组相比，N16961、VC6050和VC6055组的差异表达基因数量分别为1274、796和220个。KEGG富集分析表明，VC6055组的DEGs主要富集于病毒蛋白与细胞因子互作、IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作等通路；VC6050组主要涉及神经活性配体-受体互作和细胞黏附分子通路；N16961组则显著富集于炎症相关通路如细胞因子-细胞因子受体互作、TNF信号通路和NF-κB信号通路。炎症相关基因（如CCL2、CCL8、CXCL1、CXCL9、CXCL10）表达显著上调，且炎症通路中的富集基因数量按N16961、VC6050、VC6055顺序递减。

与N16961组相比，新型谱系菌株VC6050和VC6055共有187个下调基因和165个上调基因。下调基因主要涉及IL-17、TNF和NF-κB等炎症通路，PPI网络核心包括IL-11、IL-18、TNFα、CXCL10等炎症因子；而上调基因包括羧酸酯酶基因（Ces2b、Ces1c、Ces2c）、水通道蛋白介导转运相关基因（AQP8、AQP12、Gng8）及部分炎症相关基因（如ACER1和Cysltr1）。与PBS组相比，N16961感染后羧酸酯酶表达降低，VC6050感染后升高，VC6055组无变化。

与非产毒株VC6055相比，产毒株N16961和VC6050共有250个DEGs，其中177个基因上调，富集于IL-17信号通路、NOD样受体信号通路及转录调控基因（如FOS、AP-1）。PPI网络显示，上调基因分为两类：炎症相关基因（如NLRP3、CD14、IL18、S100a8/a9）和防御素基因（如Defa23、Defa29等）。下调基因主要为羧酸酯酶基因。RT-qPCR验证了RNA-seq数据的可靠性。

成年BALB/c小鼠感染霍乱弧菌后的细胞因子水平

口服接种N16961后，成年小鼠血清中仅IL-6浓度在4小时和24小时显著高于PBS对照组，其他细胞因子（IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A、TNF、IFN-γ）无显著变化。

讨论

本研究通过新生儿小鼠模型揭示，霍乱弧菌感染后肠道转录变化主要涉及免疫和炎症相关基因，如趋化因子CCL17、CCL21、CXCL9和CXCL10显著上调，这些因子与炎症细胞迁移和激活相关，与组织学观察到的炎症细胞浸润一致。与第七次大流行株N16961相比，新型谱系菌株表现出炎症相关细胞因子和趋化因子水平较低，但羧酸酯酶和水通道蛋白相关基因表达上调，提示其可能通过调节脂质代谢和肠道水分转运影响腹泻症状。

产毒株（N16961和VC6050）与非产毒株（VC6055）的比较表明，CTX阳性株不仅激活更多炎症因子（如IL-22、CXCL5），还诱导宿主产生更多抗菌肽（如Defa基因家族），从而增强先天免疫防御。CXCL5作为中性粒细胞趋化因子，可能促进中性粒细胞向小肠募集，增强产毒株的定植能力。而非产毒株仍可通过鞭毛蛋白和脂多糖等成分触发炎症反应。

成年小鼠模型中仅IL-6显著升高，表明成年鼠可能非研究霍乱弧菌免疫反应的理想模型，与既往研究一致。综上所述，新型谱系霍乱弧菌通过独特基因表达模式调控宿主炎症反应，为理解其致病机制和宿主互作提供了关键实验证据。