糖酵解特征预测泛癌免疫检查点抑制剂应答及FH缺陷肾癌中LDHA作为联合靶点的多组学分析

本综述通过整合多组学分析，揭示糖酵解特征（Glyc.Sig）可预测泛癌免疫检查点抑制剂（ICI）应答，并鉴定乳酸脱氢酶A（LDHA）作为延胡索酸水合酶缺陷型肾细胞癌（FH-deficient RCC）的潜在联合治疗靶点，为克服免疫治疗耐药提供了代谢干预新策略。

　　

引言

延胡索酸水合酶缺陷型肾细胞癌（FH-deficient RCC）是一种罕见但侵袭性强的恶性肿瘤，治疗选择有限且预后较差。尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）在其他癌症中显示出疗效，但在FH-deficient RCC中的反应仍不理想。代谢重塑，特别是Warburg效应驱动的糖酵解，与免疫逃逸和肿瘤进展相关，这凸显了预测性生物标志物和组合策略的需求。

方法

研究整合了41个单细胞RNA测序（scRNA-Seq）数据集（涵盖19种恶性肿瘤、405名患者和1,220,365个细胞），开发了糖酵解特征（Glyc.Sig）。验证包括泛癌转录组分析（30种癌症类型，n=10,154）、CRISPR筛选数据（4种癌症）和临床免疫治疗队列（5种癌症，n=921）。通过CRISPR筛选分析，LDHA被确定为顶级免疫耐药候选基因，并在仁济医院队列中通过免疫印迹和免疫组织化学验证。

结果

Glyc.Sig在多种恶性肿瘤中表现出糖酵解活性与ICI疗效之间的强负相关。它在预测免疫治疗结果方面优于传统生物标志物。CRISPR筛选将关键糖酵解酶LDHA列为增强ICI应答的靶点。临床验证证实FH-deficient RCC肿瘤组织中LDHA表达升高，这可能与免疫抑制微环境和ICI耐药相关。LDHA抑制与ICI联合治疗可能显示出协同抗肿瘤效应。

讨论

本研究将Glyc.Sig确立为一种双重诊断-预测生物标志物系统，将糖酵解重编程与免疫逃逸联系起来。比较验证显示，其预测ICI反应的能力优于现有分子特征。LDHA抑制成为克服FH-deficient RCC和其他糖酵解肿瘤中ICI耐药的有前景策略。这些发现强调了靶向癌症代谢以优化免疫治疗疗效的治疗潜力。

背景

FH-deficient RCC是由延胡索酸水合酶（FH）基因功能失活引起的罕见但临床显著的肾恶性肿瘤亚型。这种侵袭性肿瘤因非特异性组织学特征而呈现诊断复杂性，需要综合诊断方法，包括免疫组织化学分析显示FH蛋白丢失和2SC表达增加，并辅以分子检测确认FH基因突变。尽管发生率低，FH-deficient RCC表现出侵袭性进展，常晚期诊断。晚期疾病患者预后差，中位生存期为18至24个月，凸显了改进治疗策略的紧迫性。

免疫检查点抑制剂（ICIs）已彻底改变肿瘤治疗，在多种恶性肿瘤中显示出前所未有的临床疗效。新兴证据表明，FH-deficient RCC具有高度免疫原性微环境。临床试验显示，与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）单药治疗相比，ICIs与TKIs联合在转移性FH-deficient RCC患者中具有更优疗效，客观缓解率达到43.2%。然而，相当比例病例仍难以实现持续临床缓解。当前治疗策略的持续局限性，特别是在晚期疾病阶段观察到的 modest 缓解率，凸显了开发稳健预测生物标志物的迫切需求。此类进步将实现更精确的患者选择，并指导针对免疫逃逸途径和致癌信号 cascades 的优化组合方案设计。

癌细胞经历代谢重塑，主要表现为依赖糖酵解维持生存和满足其生物合成/能量需求。这种适应性策略，称为Warburg效应，不仅赋予恶性细胞增殖优势，还塑造了免疫抑制肿瘤 niche，促进癌症进展。 elevated 糖酵解促进乳酸产生， acidifies 肿瘤微环境（TME），抑制细胞毒性T细胞活性，并 foster 免疫抑制细胞如调节性T细胞（Tregs）和髓源性抑制细胞（MDSCs）。当前预后模型主要关注单一癌症类型，而FH deficiency 诱导的代谢失调——Warburg效应——在多种实体瘤中普遍存在。因此，利用泛癌免疫治疗队列构建跨癌症糖酵解相关预后模型可能揭示 universal 生物标志物，并为罕见FH-deficient RCC亚型提供 extrapolation 验证基础。

本研究的主要目标是调查肿瘤糖酵解活性在调节ICIs疗效中的作用，并开发基于多种恶性肿瘤糖酵解活性的稳健预后模型。我们旨在识别一种糖酵解特征（Glyc.Sig），可作为预测实体瘤中ICIs疗效的 universal 生物标志物，并 uncover 潜在治疗靶点以增强ICIs反应性。通过整合来自多种癌症类型的scRNA-seq数据以及临床免疫治疗结果，本研究寻求将Glyc.Sig确立为指导治疗策略的预测工具。此外，将探索功能性CRISPR筛选数据集，以识别有前景的靶点，这些靶点可能增强不同恶性肿瘤中ICIs的反应性。

材料与方法

批量RNA分析FH-deficient RCC队列

分析了来自仁济医院先前研究的批量RNA-seq数据，包括三名FH-deficient RCC患者的配对原发肿瘤和 adjacent 正常组织，以评估差异基因表达模式及其在糖酵解中的功能作用。此外，采用另一个FH-deficient RCC批量RNA-seq队列（GSE157256数据集）调查转移、原发肿瘤和 adjacent 正常组织之间的不同表达模式。

scRNA-seq ICI队列分析糖酵解-免疫治疗链接

为探索糖酵解与ICI反应之间的关联，评估了四个scRNA-seq数据集：一个FH-deficient RCC队列（来自Clin Cancer Res文章）、一个透明细胞肾癌（ccRCC）队列（SRP308561）、一个皮肤 cutaneous 黑色素瘤（SKCM）队列（GSE115978）和一个基底细胞癌（BCC）队列（GSE123813）。获得的基因表达矩阵转换为Seurat对象，所有后续分析使用R软件进行。首先使用DoubletFinder包去除 probable doublets。整合所有样本的Seurat对象后，应用严格质量控制（QC）过滤器排除符合以下任何标准的细胞：检测基因>7,500或<200，总reads>75,000，或线粒体RNA含量>20%。合格细胞通过Seurat中的LogNormalize方法进行 normalization 和 scaling，同时识别高变基因。对高变基因矩阵进行主成分分析（PCA），基于 elbow plot 拐点和 heatmap 驱动的方差贡献评估选择显著主成分（PCs）。使用这些PCs，构建k近邻图（FindNeighbors），并以分辨率参数1执行基于图的聚类（FindClusters）。通过UMAP投影可视化聚类身份，数据来源文献提供所有聚类的细胞注释。

使用分子特征数据库（MSigDB）的糖酵解相关基因，通过基因集变异分析（GSVA）计算糖酵解通路富集分数。队列细节总结于补充表S1。

泛癌scRNA-seq数据集用于糖酵解特征开发

使用41个scRNA-seq数据集（405名患者，1,220,365个细胞，21种癌症类型，补充表S2）开发泛癌糖酵解特征（Glyc.Sig），这些数据集包括来自Gene Expression Omnibus（GEO）和TISCH门户的恶性、基质和免疫细胞，以及直接来自发表文章的数据。这些包括乳腺癌（BRCA）、基底细胞癌（BCC）、透明细胞肾细胞癌（ccRCC）、结直肠癌（CRC）、胆管癌（CHOL）、胶质瘤、FH-deficient RCC、头颈癌（HNSC）、肝细胞癌（LIHC）、多发性骨髓瘤（MM）、Merkel细胞癌（MCC）、髓母细胞瘤（MB）、非小细胞肺癌（NSCLC）、神经内分泌肿瘤（NET）、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、胰腺腺癌（PAAD）、皮肤 cutaneous 黑色素瘤（SKCM）、胃腺癌（STAD）和葡萄膜黑色素瘤（UVM）。

泛癌转录组分析Glyc.Sig与免疫抑制的潜在相关性

分析来自UCSC Xena数据门户的TCGA泛癌转录组数据（10,154名患者；30种癌症类型），以评估Glyc.Sig与免疫抑制之间的关联。由于免疫细胞 predominance，排除急性髓系白血病（AML）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBC）和胸腺瘤（THYM）。来自cBioPortal的肿瘤突变负荷（TMB）数据和来自发表文章[Thorsson等]的肿瘤内异质性（ITH）数据被引入，以评估它们与通过GSVA计算的Glyc.Sig分数的相关性。

ICI RNA-seq队列用于基于Glyc.Sig的预测建模

使用来自10个ICI RNA-seq队列的预处理转录组数据和临床信息，开发和验证基于Glyc.Sig的预测模型。这些包括五个SKCM队列（由Van Allen 2015、Riaz 2017、Hugo 2016、Liu 2019和Gide 2019提供）；一个肾细胞癌（RCC）队列（由Braun 2020提供）；两个尿路上皮癌（UC）队列（来自Mariathasan 2018和Synder 2017）；一个胶质母细胞瘤（GBM）队列（来自Zhao 2019）；和一个胃癌（GC）队列（来自Kim 2018）。详细队列特征展示于补充表S3。

CRISPR筛选用于免疫耐药基因识别

分析了来自Freeman、Kearney、Manguso、Pan、Patel、Vredevoogd和Lawson先前研究的七个CRISPR/Cas9筛选数据集，涵盖多种癌症类型（BRCA、CRC、RCC和SKCM），以识别免疫耐药相关基因。遵循Fu等（他们策划了前六个数据集，除Lawson队列外），我们将这7个数据集的数据分为17个 distinct 组（补充表S4）。CRISPR筛选方法框架涉及在癌症细胞系中进行全基因组CRISPR-Cas9敲除，这些细胞系经受细胞毒性淋巴细胞（CTL）共培养/未经受CTL（体外），或在免疫缺陷或免疫 competent（体内）小鼠中的异种移植模型，随后通过RNA测序（RNA-seq）进行sgRNA丰度量化。通过计算实验对（CTL处理与未处理；免疫缺陷与免疫 competent 小鼠）之间sgRNA reads的对数折叠变化来量化免疫调节效应。随后进行Z分数 normalization 以进行跨数据集比较。通过所有数据集的平均Z分数确定基因排名，低Z分数的顶级排名基因被视为免疫耐药 potential mediators。

糖酵解评分、通路分析和免疫分析

使用GSVA（R包“GSVA”）计算HALLMARK通路、Glyc.Sig和糖酵解强度（使用从MsigDB获得的糖酵解相关基因）的分数。使用来自Reactome知识库和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库的数据，通过R包“clusterProfiler”进行通路富集分析。使用R包MCP-counter v1.1.0量化免疫浸润。

ICI反应预测模型开发

队列整合和预处理

合并了五个RNA-seq队列，即Riaz 2017 SKCM、Mariathasan 2018 UC、Liu 2019 SKCM、Gide 2019 SKCM和Braun 2020 RCC，包括772名患者（181名RCC、348名UC和243名SKCM患者）。使用ComBat方法减轻批次效应。将队列分为训练（80%，n=618）和验证（20%，n=154）集，以及一个独立测试集（n=149），包括五个额外队列：Van 2015 SKCM、Hugo 2016 SKCM、Snyder 2017 UC、Kim 2018 GC和Zhao 2019 GBM。

模型优化和验证

训练了七种机器学习算法，即AdaBoost分类树（AdaBoost）、提升逻辑回归（LogitBoost）、cancerclass、k近邻（KNN）、朴素贝叶斯（NB）、随机森林（RF）和支持向量机（SVM），采用五折交叉验证（10次优化迭代，不同随机种子）。对于cancerclass，使用整个训练集进行模型训练，因为cancerclass不需要参数。随后，我们使用验证集测试这些模型的性能。选择 top-performing 模型进行独立测试。通过最终模型评估预测风险分层（“R”与“NR”）以进行生存分析。

比较特征分析

将Glyc.Sig与六个已发表的ICI反应特征[INFG.Sig、T.cell.inflamed.Sig、PDL1.Sig、LRRC15.CAF.Sig、NLRP3.Sig和Cytotoxic.Sig]进行比较，使用个体AUC和跨10个ICI队列的平均AUC值。这六个特征的算法和代码先前在其原始研究中使用。这些特征的详细信息展示于补充表S5。

免疫组织化学

在仁济医院对五名FH-deficient RCC患者的肿瘤样本和 adjacent 正常组织进行免疫组织化学（IHC）染色，经伦理委员会批准。实验步骤包括：1. 石蜡切片与一抗LDHA（Proteintech 19987-1-AP，兔多克隆）孵育。2. 随后应用 peroxidase 偶联山羊抗兔IgG二抗（Jackson ImmunoResearch 111-035-003）。3. 使用3,3′-二氨基联苯胺（DAB，Sigma-Aldrich D8001）进行显色检测， coupled with 苏木精 counterstaining 用于核可视化。最终IHC评分通过乘以目标蛋白表达细胞阳性百分比得分来确定。

配对肿瘤和 adjacent 组织的免疫印迹分析

将FH-deficient RCC患者的肿瘤和 adjacent 正常组织在2% SDS中裂解，随后在99°C热变性30分钟。蛋白质通过SDS-PAGE分离，然后转移至 nitrocellulose 膜。在室温下用3% BSA在TBST中封闭1小时后，膜与一抗在4°C overnight 孵育。用TBST洗涤三次后，膜与 species-matched HRP偶联二抗（1:5,000稀释）在环境温度下孵育1小时。使用化学发光（Thermo Fisher Scientific）可视化蛋白质条带。每名患者的配对样本始终在同一凝胶上运行以确保可比性。本研究中使用的抗体包括抗LDHA（19987-1-AP，Proteintech）和抗β-actin（66009-1-Ig，Proteintech）。

统计方法

在R v4.3.1中进行分析。采用双侧Wilcoxon检验比较ICI反应组和非反应组之间的糖酵解分数。Spearman相关分析评估了Glyc.Sig与其他生物特征之间的关联，包括HALLMARK通路分数、免疫相关基因、ITH、TMB和免疫浸润。通过Benjamini–Hochberg调整FDR。基于R包cancerclass和caret进行模型训练、验证和测试。通过ROC和AUC评估模型的预测性能。使用Cox回归分析生存差异。

结果

癌症糖酵解与ICI耐药相关

FH-deficient RCC是一种由延胡索酸水合酶基因失活驱动的侵袭性癌症综合征。为调查与FH-deficient RCC相关的潜在表型，我们利用了我们先前研究中仁济队列的数据，该数据包含三名FH-deficient RCC患者的原发癌症和 adjacent 正常组织的批量RNA-seq数据。之后，我们比较了癌症和 adjacent 正常组织之间不同基因的表达水平，一些糖酵解相关基因，如ENO1、PLOD2和PKM，表达上调。考虑到FH的功能丧失突变引发代谢危机，其特征是三羧酸（TCA）循环 flux 缺陷，迫使细胞代谢重编程转向有氧糖酵解，我们推测糖酵解在FH-deficient RCC癌症组织中可能更活跃。因此，我们进行了糖酵解通路的GSEA分析， predictably，在FH-deficient RCC癌症组织中存在糖酵解通路的显著正富集。接下来，我们调查了FH-deficient RCC中糖酵解与ICI结果之间的关系。t-SNE可视化显示，疾病进展（PD）患者的糖酵解水平显著高于部分缓解（PR）患者。特别是，与其他细胞类型相比，糖酵解在癌细胞（上皮细胞）中更富集。由于糖酵解是一种关键代谢途径，在许多癌症中经常上调，我们在另一种肾癌类型透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中检验了上述发现，并观察到类似发现，进一步支持糖酵解在影响ICI治疗结果中的潜在作用。

为进一步调查糖酵解在ICI反应中的作用，在BCC和SKCM癌症数据集中探索了ICI结果与糖酵解强度之间的关系。在BCC中，非应答者（NR）表现出比应答者（R）更高的糖酵解强度。定量分析进一步证实了这一发现，显示NR亚组的糖酵解强度显著高于R亚组。对于SKCM，使用了一个额外数据集，该数据集排除了缺乏恶性细胞数据的样本，以验证发现。然而，由于一些应答者数据缺失，比较在治疗 naive（TN）患者和NR之间进行。假设治疗 naive 患者可能包括潜在应答者和非应答者。分析还显示，在SKCM队列中，NR亚组的糖酵解强度显著高于TN亚组。

基于泛癌scRNA-seq数据集开发Glyc.Sig

由于糖酵解强度与ICI耐药显著相关，我们建议一个包含反映糖酵解水平基因的基因集，称为糖酵解特征（Glyc.Sig），可能有助于预测ICI反应。因此，我们利用41个泛癌scRNA-seq数据集开发Glyc.Sig。最初采用肿瘤糖酵解富集分数与基因表达水平之间的Spearman相关。Gx基因集包含与糖酵解强度分数正相关的基因（R>0且FDR<1e?05）。Gy基因集包含在恶性细胞中显著过表达的基因。我们在每个数据集内交集Gx和Gy以制定Gn基因集（n=1,2,…,41），其中包含与糖酵解强度正相关的肿瘤特异性上调基因。对于G1–G41基因集中的每个基因，我们计算了Spearman R值的几何平均值，最终R平均值大于0.3的基因被选择形成Glyc.Sig。详细基因列表展示于补充表S6。Glyc.Sig的生成简化过程可直观观察。此外，基于Reactome和KEGG的通路分析被采用以探索Glyc.Sig的生物学功能。过 represented 通路主要与糖酵解、缺氧、KEAP1-NFE2L2通路、G1/S DNA损伤检查点、谷胱甘肽代谢和碳水化合物代谢过程相关。

调查Glyc.Sig与免疫力的潜在相关性

我们首先调查了Glyc.Sig与75个免疫相关基因之间的关系，包括HLA集、刺激集和抑制集。在30种不同癌症类型中，几乎所有75个基因都发现普遍负相关。展示了免疫细胞浸润的情况。较高水平的糖酵解强度与各类免疫细胞浸润负相关，包括细胞毒性细胞（CD8 T细胞、细胞毒性淋巴细胞、NK细胞）、B系细胞和髓样树突状细胞。上述分析表明，高糖酵解强度肿瘤中抗肿瘤免疫力降低。

接下来，我们探索了HALLMARK通路富集与Glyc.Sig表达强度之间的链接。两者均通过GSVA计算。所有前10个HALLMARK通路，包括DNA修复、MYC信号和糖酵解，与Glyc.Sig表达强度正相关。所有这些通路可能基于先前研究与弱免疫反应相关。我们还探索了三级淋巴结构（TLS）相关基因富集与Glyc.Sig表达强度之间的关系。TLS分数以及大多数TLS相关基因与Glyc.Sig表达强度负相关。值得注意的是，高TLS分数和相关基因通常表明丰富的免疫细胞浸润。此外，我们调查了Glyc.Sig中位数分数与中位数ITH以及中位数TMB之间的关系。ITH是促进免疫抑制的特征。正如预期，Glyc.Sig表达强度与ITH正相关。然而，发现TMB与Glyc.Sig之间存在正相关，这似乎与我们当前对TMB的理解相悖。通常，较高的TMB意味着更好的免疫反应，因为抗原性丰富，而高水平的Glyc.Sig则相反。基于Glyc.Sig中位数GSVA分数和中位数TMB作为分组标准，患者被分为四个 distinct 亚组：高Glyc.Sig/高TMB（HGHT）、高Glyc.Sig/低TMB（HGLT）、低Glyc.Sig/高TMB（LGHT）和低Glyc.Sig/低TMB（LGLT）。首先，我们阐明高Glyc.Sig和低TMB均具有降低的细胞毒性淋巴细胞浸润，这与我们当前的理解一致。我们进一步比较了LGLT、LGHT、HGLT和HGHT亚组之间的免疫细胞浸润。LGHT被确定为具有最高细胞毒性淋巴细胞和NK细胞浸润的组，而HGLT被发现具有大多数免疫细胞的最低浸润，包括细胞毒性淋巴细胞、单核系、CD8 T细胞、NK细胞、T细胞和B系。至于LGLT和HGHT亚组，情况似乎不明确，可能原因是这两个亚组同时具有免疫刺激因子和抑制因子。

基于Glyc.Sig预测免疫治疗反应

为探索Glyc.Sig的预后价值，策划并分析了来自10个ICI队列的批量RNA-seq数据和相应临床数据，以构建基于Glyc.Sig的ICI反应预测模型。为更好利用这些数据，我们将它们分为三个子集：训练集用于基于五折交叉验证重复10次的模型训练和参数调优（cancerclass除外）；验证集用于根据AUC进行模型比较和选择；独立测试集用于最终模型诊断。流程图反映了整个过程。最初纳入了七种不同模型并进行训练；最终选择朴素贝叶斯作为具有最高AUC 0.69的Glyc.Sig模型。接下来，我们利用独立测试集通过预测ICI反应对Glyc.Sig模型进行进一步评估。最终观察到AUC为0.66。

为评估Glyc.Sig对总生存期（OS）的预测价值，根据Glyc.Sig模型给出的ICI反应预测，将患者分为高风险组（预测非应答者，NR）和低风险组（预测应答者，R）。Kaplan–Meier生存分析表明，在验证和测试队列中，高风险组的OS显著短于低风险组。在验证队列中，低风险组的中位OS为29.9个月（HR=1.83，95%CI 1.17–2.86）， nearly 翻倍于高风险对应组的OS（14.42个月）。在测试队列中，低风险患者的中位OS为31.7个月，而高风险受试者的OS为11.23个月（HR=2.28，95%CI：1.27–4.09）。随后，我们检查了Glyc.Sig预测模型在10个ICI RNA-seq队列中的性能。这10个队列的AUC范围从0.53到0.91，其中Riaz 2017的SKCM队列AUC最高（AUC=0.91，95%CI：0.82–0.99），其次是Mariathasan 2018的UC队列（AUC=0.90，95%CI：0.87–0.94）。Zhao 2019的GBM队列表现出最低预测准确性（AUC=0.53，95%CI：0.24–0.82），这可能归因于其受限样本量。至于生存分析，由于缺乏OS数据，排除了Kim 2018的GC队列。对于其余九个队列，由Glyc.Sig模型预测的高风险患者显示出显著的生存获益。在2015年Van Allen的SKCM队列、2017年Synder的UC队列、2018年Mariathasan的UC队列、2019年Liu的SKCM队列和2019年Gide的SKCM队列中观察到显著观察。

通过计算每个基因特征的AUC，比较了Glyc.Sig与其他 well-constructed 预测基因特征。与其他基因特征相比，Glyc.Sig在验证队列中表现最佳，AUC为0.69。此外，Glyc.Sig在10个个体ICI队列中的大多数中表现最佳，而大多数其他特征仅在一个或两个队列中表现理想。我们还比较了这些基因特征在10个个体ICI队列上的平均AUC。值得注意的是，Glyc.Sig以平均AUC 0.76主导列表，超过第二特征（INFG.sig）的AUC 0.62。

基于Glyc.Sig调查潜在治疗靶点

收集了来自七个CRISPR队列的基因敲除 corresponding 免疫反应数据。这些队列根据采用的模型细胞和治疗进一步分为17个数据集。这些数据集共记录了22,505个基因。通过根据平均Z分数对基因进行排名，我们将顶级排名基因识别为免疫耐药，表明它们的敲除可以增强抗肿瘤免疫力。相反，底部排名基因被分类为免疫敏感，表明它们的敲除可能抑制抗肿瘤免疫力。排名过程如图所示。在22,505个基因中，排名前5%、10%和20%的基因数量分别为1,125、2,250和4,501。为进一步调查Glyc.Sig的免疫治疗价值，我们随后计算并比较了Glyc.Sig中排名前5%、10%和20%基因的比例，与其他已报道的免疫耐药基因特征，包括TcellExc.Sig、ImmuneCells.Sig、IMS.Sig、LRRC15.CAF.Sig和CRMA.Sig。由于IPRES特征由通路而非基因组成，将其排除。正如预期，Glyc.Sig具有最高比例的重叠顶级排名基因，与其他基因特征相比。免疫耐药基因（那些在前20%中的）在Glyc.Sig中显著富集。Glyc.Sig中的27个基因，包括PSMF1、GCLC、CES1、MAF1、LDHA、KLHL24、FCGR2B、POLR2K、MCCC1、GPI、COMMD8、C19orf24、DNAJC12、YDJC、HSPB7、DERL1、NDUFA4L2、AGTRAP、RNF128、MRPL10、EIF5A2、B3GNT3、SSR1、DNAJC2、SDCCAG8、TPI1和CKAP4，排名前20%。使用一系列独立CRISPR数据集验证了肿瘤免疫调节与这些糖酵解相关基因之间的关系，表明它们作为与免疫检查点阻断（ICB）联合的治疗靶点的潜力。

鉴于糖酵解上调和Glyc.Sig在FH-deficient RCC和泛癌数据中的预测价值，我们假设CRISPR队列的中心基因LDHA可能在此过程中起关键作用。LDHA编码糖酵解的最终步骤，其中丙酮酸转化为乳酸，生成ATP。对FH-deficient RCC scRNA-seq数据集的分析显示，与其他细胞类型相比，LDHA表达在FH-deficient RCC上皮细胞中显著更高。此外，当使用GSE157256数据集比较转移、原发肿瘤和 adjacent 正常组织之间的LDHA表达时，我们发现 adjacent 正常组织中的LDHA水平显著较低。为进一步确认这些结果，来自仁济医院患者的免疫印迹分析和IHC染色显示，与正常 adjacent 组织相比，肿瘤组织中的LDHA表达显著更高。

讨论

常规生物标志物发现主要依赖于全外显子组测序（WES）或批量组织RNA-seq分析。这些方法学受限于其无法解析细胞异质性，生成 population-averaged 遗传谱， obscuring 关键细胞亚型特异性变异。来自批量分析的现有免疫检查点抑制剂生物标志物的有限预测准确性突出了固有技术限制。单细胞RNA测序的突破彻底改变了生物标志物发现，通过在单个细胞水平实现高分辨率转录组分析，从而 uncover 以前无法检测的分子模式，具有 enhanced 预后能力。

FH-deficient RCC是一种罕见但侵袭性恶性肿瘤，缺乏 established 治疗标准，为这种致命状况创造了治疗选择的关键空白。这些肿瘤表现出 heightened 免疫原性，以丰富的淋巴细胞浸润和检查点蛋白过表达为标志，表明 responsive 微环境。近期研究报道，在晚期FH-deficient RCC中，ICIs与酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）联合 across