基于粪便和唾液微生物组特征的无创诊断策略揭示结直肠癌（CRC）演进中的阶段特异性生态动态

本研究发现结直肠癌（CRC）患者粪便与唾液微生物组在疾病进展（非转移/转移阶段）呈现显著动态变化，唾液源菌群向肠道易位增强；通过16S rDNA测序与网络分析揭示微生物互作稳定性改变，并构建基于粪便ASVs的随机森林模型实现高精度（AUC >93%）阶段判别，为CRC无创诊断提供新型微生物标志物。

　　

背景

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球癌症相关死亡的第二大原因，2022年新增病例约192万，死亡约90万，其中中国占24万。尽管筛查对50–75岁人群具有明确的净获益，但由于结肠镜检查的高成本、侵入性及繁琐准备，中国高危人群筛查率仅14%。此外，非特异性症状和临床生物标志物的缺乏阻碍了CRC的早期发现与干预，约60%的患者确诊时已出现局部或远处转移，5年生存率低于20%。因此，迫切需要开发有效的预测CRC发生及转移的无创手段。

近年来，微生物组研究揭示了肠道菌群与CRC之间的密切关联。粪便菌群作为动态界面，与环境因素及宿主健康相互作用，通过遗传毒性、信号转导、炎症、免疫及代谢等机制参与疾病发生。口腔作为消化道入口，其复杂的唾液微生物组与粪便菌群通过口腔-肠道易位密切相关。特定口腔细菌在CRC患者肠道菌群中的富集，提示其作为非侵入性生物标志物的潜力。然而，既往研究多忽视CRC进展中口腔-肠道菌群易位的作用，且粪便与唾液微生物组在转移性CRC中的关联及其诊断价值尚未明确。

方法

本研究于2023年10月至2024年9月期间，招募了30例转移性CRC患者（M组）、30例非转移性CRC患者（NM组）及30例健康对照（NC组）。收集所有受试者的粪便和唾液样本，采用16S rDNA V3–V4区测序及生物信息学分析进行微生物谱解析。通过主坐标分析（PCoA）、非度量多维尺度分析（NMDS）、随机森林模型及网络分析等方法，比较组间微生物组成、互作网络及诊断效能。

结果

参与者

三组在性别、年龄、BMI及合并症方面无显著差异。CRC患者原发肿瘤位置分布如下：NM组包括7例左结肠癌（LCC）、10例右结肠癌（RCC）和13例直肠癌（RC）；M组包括10例LCC、7例RCC和13例RC。病理类型以腺癌为主（58例），M组中2例为神经内分泌肿瘤。血清肿瘤标志物（CEA、CA-199、CA-125）在M组与NM组间存在显著差异。

粪便微生物组组成在CRC不同阶段存在差异

PCoA和NMDS分析显示，三组间粪便微生物β多样性（Bray–Curtis，p=0.01）存在显著差异。在门水平，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）和梭杆菌门（Fusobacteria）为优势菌门。M组中Firmicutes比例（45.68%）显著低于NM组（51.18%）和NC组（52.94%），而Actinobacteriota比例呈递增趋势（NC 5.73% vs. NM 5.83% vs. M 12.05%）。在属水平，拟杆菌属（Bacteroides）沿NC-NM-M序列比例递增（NC 10.92% vs. NM 11.44% vs. M 16.45%），而普雷沃菌属₉（Prevotella_9）在NC组中显著富集（NC 13.24% vs. NM 0.97% vs. M 5.12%）。埃希菌-志贺菌属（Escherichia–Shigella）相对丰度呈递减趋势（NC 4.70% vs. NM 4.58% vs. M 2.68%）。

特异性粪便微生物类群在CRC进展中发生改变

热图分析显示，M组富集真杆菌属（Eubacterium eligens group）、UGG-002、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、拟杆菌属（Bacteroides）、萨特菌属（Sutterella）、韦荣球菌属（Veillonella）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）；NM组富集链球菌属（Streptococcus）、阿克曼菌属（Akkermansia）、梭杆菌属（Fusobacterium）、瘤胃球菌属_{gnavus group}、瘤胃球菌属_{torques group}、柯林斯菌属（Collinsella）、 Phascolarctobacterium、Fusicatenibacter和克雷伯菌属（Klebsiella）。箱线图进一步揭示了10个在属和种水平呈递增或递减趋势的类群，例如变形菌属（Proteus）和普雷沃菌属₇（Prevotella_7）丰度增加，而巨单胞菌属（Megamonas）和Agathobacter丰度下降。

唾液微生物组组成在CRC不同阶段存在差异

唾液样本分析显示，三组间微生物群落组成存在显著差异（Bray–Curtis，p=0.001）。门水平上，优势菌门包括变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteriota）、放线菌门（Actinobacteriota）和弯曲菌门（Campylobacterota）。M组中Bacteroidota和Campylobacterota富集，而NC组中Proteobacteria丰度较高。属水平上，奈瑟菌属（Neisseria）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、普雷沃菌属₇（Prevotella_7）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、梭杆菌属（Fusobacterium）、普雷沃菌属（Prevotella）、韦荣球菌属（Veillonella）、链球菌属（Streptococcus）、纤毛菌属（Leptotrichia）和别普雷沃菌属（Alloprevotella）占主导。其中，Neisseria丰度随疾病进展下降，而Fusobacterium和Prevotella丰度增加。

特异性唾液微生物类群在CRC进展中发生改变

热图及箱线图分析揭示了10个在属和种水平呈显著变化的唾液微生物类群。例如，Prevotella、Atopobium、乳杆菌属（Lactobacillus）、Escherichia?Shigella、Akkermansia、克雷伯菌属（Klebsiella）、Solobacterium、毛螺菌科NK4A136组（Lachnospiraceae NK4A136 group）、Subdoligranulum和Scardovia丰度增加，而弧菌属（Vibrio）、Bosea、Simonsiella、Succinivibrionaceae UCG?001和F0332丰度下降。

微生物共现网络在CRC进展中发生动态变化

基于SparCC算法构建的粪便（139个ASVs）和唾液（281个ASVs）微生物共现网络显示，CRC进展中网络结构呈现阶段特异性模式。自然连通性分析表明，随着疾病进展，粪便微生物网络的稳定性逐渐降低，而唾液微生物网络的稳定性增强。Source Tracker分析显示，唾液源菌群在粪便中的检出率（M组63.3% vs. NM组50.0% vs. NC组46.7%）及相对比例（M组14.9% vs. NM组3.2% vs. NC组1.7%）均随CRC进展递增，表明口腔-肠道菌群易位加剧，可能驱动肠道菌群失调及网络不稳定性。

基于ASVs的粪便生物标志物实现精确的阶段特异性诊断，性能优于唾液ASVs分类器

差异分析发现，M组与NC组间差异粪便物种数（128个）及唾液物种数（179个）均高于NM组与NC组间（粪便39个，唾液34个）。随机森林模型结合五折交叉验证显示，基于前8个粪便ASVs（按MeanDecreaseGini排序）的三分类模型总体准确率达78.95%，Cohen’s Kappa为0.68，宏平均F1-score为0.80；ROC分析（one-vs-rest）宏平均AUC为93.16%（NC特异性AUC=92.71%，NM特异性AUC=90.15%，M特异性AUC=96.63%）。唾液ASVs模型性能较低，总体准确率61.54%，宏平均AUC为76.15%（NC特异性AUC=67.92%，NM特异性AUC=67.43%，M特异性AUC=93.10%），表明粪便微生物标志物在CRC阶段判别中具有更优的诊断潜力。

讨论

本研究系统揭示了CRC进展中粪便与唾液微生物组的动态变化，证实口腔-肠道菌群易位随疾病进展加剧，且微生物网络稳定性呈现相反趋势。特定类群（如Bacteroides、Megasphaera、Veillonella）的富集及益生菌（如Agathobacter）的耗竭与CRC演进相关。KEGG分析提示M组中氨基酸（AA）生物合成与代谢通路富集，与既往研究一致。共现网络分析表明，健康人群微生物网络具有更高稳定性，而CRC进展中粪便网络脆弱性增加、唾液网络稳健性增强，可能与口腔源菌群易位相关。随机森林模型进一步验证了粪便ASVs在CRC阶段判别中的高精度（AUC >90%），唾液ASVs模型虽对晚期CRC（M组）有一定识别能力，但对早期差异（NC vs. NM）判别效能有限。

本研究局限性包括样本量较小、缺乏外部验证、未追踪具体易位菌株及实验验证。未来将通过多中心队列及前瞻性研究进一步评估其临床效用。

材料与方法

受试者来自浙江中医药大学附属第一医院，样本采集后于-80°C保存。DNA提取采用试剂盒法，16S V3–V4区扩增后于Illumina NovaSeq 6000平台测序。数据质控、去噪及ASV生成采用DADA2。网络分析通过SparCC算法及Gephi可视化，自然连通性通过R包igraph计算。随机森林模型采用五折交叉验证，特征选择依据MeanDecreaseGini，性能评估包括准确率、Kappa、F1-score及AUC。统计分析采用Wilcoxon、Kruskal–Wallis检验及FDR校正，p<0.05为显著。