益生菌株的表型与基因型特征分析：聚焦抗菌素耐药性（AMR）与全球健康安全

本综述系统探讨了益生菌株在抗菌素耐药性（AMR）背景下的表型与基因型特征，强调其作为潜在耐药基因（ARGs）储存库的风险。研究通过最小抑菌浓度（MIC）测试和全基因组测序，揭示了工业用益生菌株对多种临床相关抗生素的耐药性及ARGs分布（如外排泵与靶点修饰机制），并指出表型与基因型评估的结合对益生菌安全应用至关重要，为One Health框架下的AMR防控提供关键依据。

　　

引言

抗菌素耐药性（AMR）已成为全球公共卫生的重大挑战，尤其在兽医和人类医疗中使用的益生微生物领域。益生菌作为替代抗生素的潜在方案，其安全性备受关注，特别是其可能携带的可转移抗菌素耐药基因（ARGs）通过水平基因转移（HGT）传播至肠道微生物或病原体的风险。本研究旨在基于One Health理念，表征几种工业应用益生菌株的表型和基因型耐药谱，重点评估ARGs的存在与潜在移动性。

材料与方法

菌株来源与鉴定：五株益生菌——屎肠球菌（Enterococcus faecium NCIMB10415）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis DSM5749）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis DSM5750）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus DSM7133）和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici DSM16243）均分离自健康猪粪便，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行物种鉴定。

最小抑菌浓度（MIC）测定：采用CLSI标准微量稀释法，测试16种抗生素的MIC值，包括青霉素、阿莫西林、庆大霉素、泰乐菌素、氟苯尼考等。使用 cation-adjusted Mueller-Hinton broth（CAMHB）培养基，质量控株为粪肠球菌ATCC 29212。断点依据EFSA FEEDAP面板和CLSI标准判读。

全基因组测序与生物信息学分析：通过Illumina NextSeq 500平台进行配对末端测序。原始数据经FastQC质控、Cutadapt和fastp修剪与校正后，使用MEGAHIT和SPAdes进行组装。ARGs预测采用ABRicate工具（CARD和NCBI数据库）和CARD RGI，移动性评估通过MobileElementFinder和PlasFlow完成。统计过滤阈值设定为序列一致性和覆盖度≥75%。

结果

表型耐药谱：MIC测试显示，屎肠球菌对阿莫西林（16 μg/mL）、泰乐菌素（4 μg/mL）和庆大霉素（64 μg/mL）耐药，但对克林霉素敏感；基于CLSI标准，其对增效磺胺（8 μg/mL）和氟苯尼考（8 μg/mL）耐药。地衣芽孢杆菌对庆大霉素和克林霉素敏感，而枯草芽孢杆菌对这两种抗生素耐药。鼠李糖乳杆菌对阿莫西林敏感，但对庆大霉素（64 μg/mL）和克林霉素（4 μg/mL）耐药。乳酸片球菌对庆大霉素和克林霉素敏感，但对阿莫西林（16 μg/mL）耐药。四环素类中，枯草芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌对氧四环素MIC较低（0.5 μg/mL），多西环素MIC在枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳酸片球菌中分别为0.06 μg/mL、0.125 μg/mL和0.5 μg/mL。加替沙星MIC值在各菌株中介于0.5~2 μg/mL。

基因型耐药谱：全基因组测序共鉴定出27个ARGs occurrences，代表21种独特基因。ABRicate与CARD数据库检测到最多基因（17个），CARD RGI识别13个，NCBI ABRICATE仅7个。ARGs按机制分类，外排泵相关基因最为常见（20次），其次是靶点保护机制（11次）；按抗生素类别，大环内酯类耐药基因最多（6次）。移动性分析显示，仅屎肠球菌中的aac(6′)-Ii基因被预测为质粒相关（PlasFlow概率0.82），但未检测到相邻插入序列。

菌株特异性ARGs分布：地衣芽孢杆菌携带最广泛的ARGs（22次），主要涉及外排泵系统（如bmr、blt、ykkCD）和氨基糖苷核苷酸转移酶基因aadK。枯草芽孢杆菌鉴定出rphB（利福平耐药）、ermD（MLSB耐药）、bcrABC（杆菌肽耐药）和lmrB（克林霉素外排）等基因。鼠李糖乳杆菌检出AAC(6′)-Ii、msrC、efrB和dfrE等ARGs，与表型庆大霉素和克林霉素耐药一致。乳酸片球菌未检测到任何ARGs。

讨论

表型与基因型相关性：本研究揭示了表型耐药与基因型预测间的直接一致性与部分 discrepancies。例如，屎肠球菌中aac(6′)-Ii和msrC基因分别解释了庆大霉素和泰乐菌素耐药；枯草芽孢杆菌的ermD和lmrB与MLSB和克林霉素表型对应。然而，氟苯尼考耐药在枯草芽孢杆菌中未发现经典基因（如floR），可能由多药外排系统（如bmr/blt）或未检测机制介导，这反映了当前数据库的局限性和耐药机制的复杂性。

益生菌安全性与ARGs传播风险：屎肠球菌和鼠李糖乳杆菌携带的ARGs（如aac(6′)-Ii、msrC、efrB）具有临床意义，且aac(6′)-Ii的潜在质粒关联暗示HGT风险。地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的丰富耐药组（尤其外排泵基因）提示其可能作为耐药基因储存库。相反，乳酸片球菌无ARGs且表型敏感，代表更安全的益生候选菌。这些发现强调，益生菌株需综合评估ARGs内容、移动性和生态风险，尤其基于One Health视角。

数据库与工具比较：CARD数据库在ARGs检测中表现最优，凸显其在益生菌AMR分析中的可靠性。NCB I数据库的低检出率源于更新频率和覆盖范围不足，建议多数据库并行使用以减少漏检。

机制与菌属特性：外排泵主导的耐药机制在益生菌中普遍存在，反映了其作为内在防御策略的进化适应性。芽孢杆菌属的孢子形成能力与稳定性可能助长其耐药基因的持久传播，而乳杆菌属的ARGs（如tetM、ermB）的移动性记录警示其在发酵食品和饲料中的基因交换潜能。

结论

本研究全面表征了五种工业益生菌株的AMR表型和基因型谱，揭示了其对关键抗生素的耐药性及ARGs多样性。地衣芽孢杆菌拥有最广泛的耐药基因谱，而乳酸片球菌显示无ARGs的敏感 phenotype。表型-基因型一致性支持基因组预测的价值，但部分 discrepancies 呼吁更深入的机制研究。CARD数据库在ARGs注释中最为可靠。益生菌作为AMR传播潜在载体的角色不容忽视，其安全应用需整合表型测试与基因组筛查，以指导兽医和食品领域的理性菌株选择与监管政策制定，助力全球AMR防控。