下呼吸道普雷沃菌（Prevotella melaninogenica）富集与免疫检查点抑制剂肺炎及放射性肺炎的关联研究

本研究通过宏基因组测序（mNGS）揭示，下呼吸道（LRT）中普雷沃菌（Prevotella melaninogenica）的富集与免疫检查点抑制剂肺炎（CIP）及放射性肺炎（RP）的发生显著相关。该菌丰度与外周血淋巴细胞减少呈负相关，为CIP/RP的微生物学诊断和靶向干预提供了新视角。

　　

引言

免疫检查点抑制剂（如抗PD-1/PD-L1药物）的应用革新了肿瘤治疗格局，但其引发的免疫相关不良事件，尤其是免疫检查点抑制剂肺炎（CIP），限制了临床获益。CIP发生率在2.49%至19%之间，常导致抗癌治疗中断和不良预后。放射性肺炎（RP）是胸部放疗后另一重要并发症，发生率约为1%至25%。CIP与RP在临床表现和影像学特征上存在重叠，使得鉴别诊断颇具挑战性。值得注意的是，接受根治性放疗后续贯抗PD-1/PD-L1治疗的患者，CIP发生率更高。

人体微生物组与多种呼吸系统疾病的发生发展密切相关。例如，肠道微生物组通过“肠-肺轴”影响慢性阻塞性肺疾病（COPD）的进程，而粪便微生物移植则可缓解COPD的病理变化。肠道原生生物Tritrichomonas musculis能诱导肠道来源的淋巴细胞迁移至肺部，加剧哮喘并影响肺部结核分枝杆菌的全身播散。这些研究表明，管理微生物组可能是预防和治疗呼吸系统疾病的有效策略。然而，肺部微生物组在癌症治疗相关肺炎，特别是CIP和RP中的作用尚属未知。探索肺癌微生物组的失调，对于从微生物角度理解CIP/RP的发生机制，以及通过调控微生物失衡来治疗CIP/RP具有重要意义。

方法

Recruitment of patients

这项回顾性研究在上海交通大学医学院附属仁济医院进行。研究共纳入61例患者，时间跨度为2021年6月20日至2024年10月20日。其中，23例被归类为CIP/RP组（16例为CIP，7例为RP），38例被诊断为肺癌合并肺炎（LC-P）组。CIP或RP的纳入标准包括：（1）癌症患者接受过免疫治疗或放疗；（2）影像学检查显示新的肺部浸润灶（CIP的影像学模式包括隐源性机化性肺炎、磨玻璃影和间质性肺炎，而RP的影像学特征为严格符合放射野形状的磨玻璃影或实变）；（3）排除下呼吸道感染或肺部肿瘤进展；（4）患者在接受采样前2周内未使用抗生素或类固醇。

BALF collection

所有61例患者均按照标准程序采集支气管肺泡灌洗液（BALF）样本。用100mL无菌生理盐水灌洗肺部，BALF回收率超过35%。随后，用于后续宏基因组下一代测序（mNGS）的BALF样本在冷链条件下运送至医院实验室。同时收集患者采样时的临床信息和实验室检查结果。

Nucleic acid extraction, library preparation, sequencing, and bioinformatics analysis

使用TIANamp Magnetic DNA Kit（天根）提取DNA。分别使用Qubit和NanoDrop（Thermo Fisher Scientific）评估DNA的浓度和质量。使用Hieff NGS C130P2 OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI（翌圣生物）按照制造商协议制备DNA文库。使用Agilent 2100进行质量控制，并在MGISEQ-200平台上进行50 bp单端测序。原始测序数据通过bc12fastq2（版本2.20）进行拆分，并使用Trimmomatic（版本0.36）去除低质量读段、接头污染、重复读段和短（长度36bp）读段，生成高质量测序数据。通过bowtie2（版本2.2.6）比对到人类参考基因组（hs37d5）来扣除人类宿主序列。未能比对到人类基因组的读段被保留，并通过Kraken（版本2.0.7）与微生物基因组数据库进行比对以进行微生物鉴定，通过Bracken（版本2.5.0）进行物种丰度估计。微生物基因组数据库包含细菌、真菌、病毒和寄生虫的基因组或 scaffold（从GenBank release 238下载）。

Statistical analysis

使用R软件（版本4.0.1）进行微生物多样性分析。α多样性通过分类学谱进行评估，β多样性通过Bray-Curtis距离进行估算。使用PERMANOVA（vegan包）分析β多样性差异。属水平相对丰度的差异通过Kruskal-Wallis检验（Kruskal.test包）进行检验。仅比较平均丰度大于1%且检出率大于40%的属。使用线性判别分析（LDA）效应量（LEfSe）评估CIP/RP患者与LC-P患者之间微生物相对丰度的统计学差异。临床指标与属相对丰度之间的Spearman相关性通过R包cor.test确定，并通过错误发现率进行校正。整合关键微生物和显著临床指标的随机森林二分类模型通过受试者工作特征曲线（ROC曲线）进行评估。

连续变量比较使用Student t检验或Mann-Whitney U检验。分类变量使用卡方检验或Fisher精确检验探讨关联。所有显著性检验均为双尾，P值<0.05被认为具有统计学意义。

Ethical approval

本研究遵循《赫尔辛基宣言》，并获得上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会批准（KY2021-102-B）。所有患者均知情同意。

Results

Demographic information of participants

研究共纳入61例患者。其中，23例为1-2级CIP/RP（16例CIP，7例RP），38例确诊为LC-P。患者的 demographic 和临床特征详见表1。CIP/RP组患者比LC-P组更年轻。CIP/RP组的合并症包括慢性阻塞性肺疾病（COPD, 17.4%）、高血压（13%）和糖尿病（13%）。与LC-P组相比，CIP/RP组患者外周血中的淋巴细胞（P = 0.001）、嗜酸性粒细胞（EOS, P = 0.008）和白蛋白（ALB, P = 0.006）水平显著降低。在BALF中，CIP/RP组的淋巴细胞百分比（BALF-L）显著更高（P = 0.010）。CIP/RP组的C反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）、 Krebs Von den Lungen-6（KL-6）和D-二聚体水平也较高，但这些临床指标均无显著差异。

Lung microbial diversity and composition

在物种水平上，基于ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数的α多样性分析显示，两组间在ACE（P = 0.63）、Chao1（P = 0.63）、Shannon（P = 0.8）和Simpson（P = 0.92）指数上均无显著差异。此外，基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）和主成分（PC）分析也显示，β多样性无差异（P值分别为0.481和0.477）。随后分析了CIP/RP组和LC-P组的肺部微生物组成。在CIP/RP组，前五大菌门为Pseudomonadota（27.0%）、Bacteroidota（26.1%）、Bacillota（19.4%）、Actinomycetota（19.0%）和Peploviricota（3.0%）。前五大菌属为Prevotella（22.7%）、Rothia（8.7%）、Pseudomonas（7.8%）、Streptococcus（7.7%）和Veillonella（6.7%）。前五大物种为Prevotella melaninogenica（11.6%）、Rothia mucilaginosa（9.7%）、Pseudomonas aeruginosa（6.0%）、Prevotella jejuni（5.6%）和Haemophilus parainfluenzae（4.1%）。在LC-P组，前五大菌门为Bacteroidota（27.2%）、Pseudomonadota（22.2%）、Bacillota（21.6%）、Actinomycetota（17.4%）和Ascomycota（4.2%）。前五大菌属为Prevotella（19.4%）、Rothia（9.2%）、Streptococcus（6.9%）、Veillonella（6.6%）和Haemophilus（4.8%）。前五大物种为Rothia mucilaginosa（6.9%）、Prevotella melaninogenica（5.4%）、Prevotella jejuni（4.7%）、Prevotella pallens（4.1%）和Haemophilus parainfluenzae（3.7%）。

Differential microbiota analysis

进一步分析了CIP/RP组与LC-P组之间前10门、前20属和前20种相对丰度的差异。在门水平，前10门的相对丰度无显著差异。在属水平，CIP/RP组中Porphyromonas（P = 0.028）和Neisseria（P = 0.010）的相对丰度显著低于LC-P组。其他属的相对丰度在两组间无显著差异。在种水平，CIP/RP组中Prevotella melaninogenica（P = 0.018）和Cytomegalovirus humanbeta5（P = 0.010）的相对丰度显著高于LC-P组。然而，CIP/RP组中Neisseria subflava（P = 0.024）和Porphyromonas pasteri（P = 0.045）的相对丰度显著低于LC-P组。其他物种的相对丰度在两组间无显著差异。通过LEfSe分析鉴定出22个判别特征。其中，13个分类单元对CIP/RP组具有判别性，9个对LC-P组具有判别性。在属水平，Cytomegalovirus（LDA得分>4, P = 0.010）在CIP/RP组中显著更高，而Porphyromonas（LDA得分>4, P = 0.028）和Neisseria（LDA得分>4, P = 0.010）在LC-P组中更丰富。在种水平，Prevotella melaninogenica（LDA得分>4, P = 0.018）和Cytomegalovirus_humanbeta5（LDA得分>4, P = 0.010）在CIP/RP组中显著更高，而Neisseria_subflava（LDA得分>2, P = 0.024）和Porphyromonas pasteri（LDA得分>2, P = 0.045）在LC-P组中显著更丰富。

Correlation between differential microbial taxa and clinical indicators

采用Spearman相关性分析进一步探讨前20属（或种）与临床指标之间的关系。二维热图显示了结果。研究主要关注差异微生物和具有显著差异的临床指标。在属水平，Porphyromonas与所有临床指标均无相关性。Neisseria与白蛋白（ALB）呈正相关。在种水平，Prevotella melaninogenica与外周血B淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和淋巴细胞呈负相关。Cytomegalovirus humanbeta5与外周血B淋巴细胞和ALB呈负相关。Neisseria subflava和Porphyromonas pasteri与具有显著差异的临床指标无相关性。此外，典范对应分析（CCA）显示，外周血EOS、ALB和BALF-L水平与前20属或种有强烈关系。另外，构建了一个随机森林二分类模型。该模型整合了Prevotella melaninogenica以及显著临床指标（包括外周血淋巴细胞、EOS、ALB和BALF-L），得出的曲线下面积（AUC）为0.755。

Discussion

本研究探索了CIP/RP患者的LRT微生物组，分析了微生物组成和多样性，比较了CIP/RP组与LC-P组的差异，并进一步探讨了LRT微生物组与临床特征之间的关系。研究发现，CIP/RP组具有更高水平的Prevotella melaninogenica物种和BALF-L，但外周血淋巴细胞、EOS和ALB水平较低。此外，Prevotella melaninogenica物种与外周血淋巴细胞呈负相关。

Prevotella是健康肺部微生物组中最常见的属之一。作为健康人气道中定植的共生细菌 microbiota，革兰氏阴性Prevotella spp.被发现具有弱炎症特性，并能被呼吸免疫系统固有地耐受。然而，Prevotella的改变与多种疾病的发生和发展相关。De Martin等人发现，Prevotella melaninogenica在扁桃体癌中的相对丰度增加。Sylvia A.D. Rofael等人使用16S rRNA基因测序检测极早产年轻成人诱导痰中的呼吸道病原体，发现prevotella，特别是prevotella melaninogenica的相对丰度显著降低。一旦定植于胃部，Prevotella melaninogenica就与胃炎症或癌变相关。Prevotella melaninogenica在胃癌和胆汁反流性胃炎患者胃液中的相对丰度显著较高，并且该菌被发现可在小鼠中诱导胃炎症，表明Prevotella melaninogenica可能与胃癌发生有关。

Prevotella在呼吸系统疾病中的作用是复杂的。慢性气道疾病中肺部菌群失调（Prevotella spp.减少和致病性Proteobacteria增加）表明Prevotella spp.在慢性气道疾病中起保护作用。Kadi J. Horn等人表明，在小鼠肺部共感染模型中，Prevotella melaninogenica诱导先天免疫反应并增强对细菌病原体Streptococcus pneumoniae的防护，突显了气道Prevotella在呼吸道健康中的保护作用。然而，Fan Lu等人报道，作为机会性病原体，Prevotella melaninogenica可能导致免疫功能低下脓毒症诱发的急性肺损伤患者的免疫失调。本研究中，Prevotella是两组的优势菌属，但两组间无显著差异。属于Prevotella属的Prevotella melaninogenica是CIP/RP组的优势物种，也是LC-P组的第二丰富物种。与LC-P组相比，CIP/RP组的Prevotella melaninogenica物种水平显著更高。Prevotella melaninogenica的富集可能代表了其在CIP/RP中的致病性。

CIP/RP患者具有独特的临床特征，包括BALF中淋巴细胞百分比增加和外周血淋巴细胞水平降低。此外，外周血EOS和ALB的减少与CIP的发生有关。本研究中，CIP/RP组BALF-L水平显著较高，但外周血淋巴细胞、EOS和ALB水平较低，这与之前的研究一致。我们还发现Prevotella melaninogenica物种与外周血淋巴细胞呈负相关，提示了LRT microbiota与临床特征之间的相互作用。

本研究存在几个局限性。首先，CIP/RP的样本量较小。未来进行大样本研究对于验证这些发现很有价值。其次，其他物种（虽不丰富但存在显著差异）的作用尚不清楚。最后，本研究未收集健康组和CIP/RP恢复后患者的BALF和临床特征。未来研究需要阐明CIP/RP中LRT microbiota与临床特征之间的相互作用。

Conclusion

CIP/RP患者下呼吸道（LRT）中普雷沃菌（Prevotella melaninogenica）的相对丰度增加，且该菌与外周血淋巴细胞减少呈负相关，表明LRT中Prevotella melaninogenica的富集与外周血淋巴细胞水平降低相关联，可能成为CIP/RP诊断和治疗的潜在生物标志物。