薄型子宫内膜的免疫相关基因特征：转录组学与单细胞研究揭示细胞毒性免疫激活新机制

本综述通过整合转录组与单细胞测序技术，系统揭示了薄型子宫内膜（TE）中免疫相关基因（如CORO1A、GNLY、GZMA）的显著上调现象，证实了自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性等免疫激活过程的关键作用。研究为理解TE的免疫失调机制提供了新视角，并为改善子宫内膜容受性提供了潜在生物标志物和治疗靶点。

　　

背景

薄型子宫内膜（Thin Endometrium, TE）通常定义为增殖期内膜厚度≤7毫米，与子宫内膜容受性受损、胚胎植入失败、流产风险增加及生育能力下降密切相关。尽管临床认为激素不足、炎症和血管功能障碍等因素与TE有关，但其分子机制尚不明确。当前治疗方法如雌激素补充和宫腔内治疗对许多患者效果有限，因此迫切需要从基因表达特征和信号通路角度探索TE的分子基础，以开发新的治疗策略。

材料与方法

研究纳入了3例TE患者和3例内膜厚度正常的对照者，所有参与者年龄低于35岁、月经周期规律（26–30天），无吸烟史及代谢、免疫等系统性疾病。TE组子宫内膜厚度＜7毫米，对照组厚度≥8毫米且有足月妊娠史。排除标准包括内分泌疾病、近期激素治疗、子宫结构异常、活动性感染和免疫性疾病等。样本采集经深圳南山医院伦理委员会批准（批号072652），组织采集后迅速冷冻于液氮并保存于-80°C直至使用。

研究采用RNA-easy试剂提取总RNA，通过去除核糖体RNA（rRNA）构建链特异性文库，使用BGISEQ平台进行高通量测序，每样本产生约6 Gb数据。数据处理包括FastQC、Trim Galore和Cutadapt进行质控，STAR进行序列比对，StringTie和RSEM完成基因定量，FPKM和TPM进行标准化。差异表达基因（DEGs）通过DESeq2包识别（调整p值<0.05且倍数变化>1.5）。基因本体（GO）富集分析使用clusterProfiler包。此外，整合了NCBI SRA数据库中公开的单细胞RNA-seq数据（登录号PRJNA730360），利用Seurat包进行质控、标准化、降维和聚类分析，并通过t-SNE/UMAP可视化细胞亚群。关键基因通过qPCR验证，使用β-Actin作为内参，采用ΔΔCt法计算相对表达量。

结果

3.1 转录组测序与基因表达谱分析

RNA-seq分析共鉴定出57个显著DEGs，其中33个上调、24个下调。上调基因主要富集于免疫相关功能，如细胞迁移与活化；下调基因则涉及细胞增殖和信号转导通路。GO分析显示，上调基因显著关联免疫应答、炎症信号、氧化应激和细胞周期调控，特别是自然杀伤（NK）细胞活化、免疫细胞介导的细胞毒性及氧化应激反应。分子功能方面，上调基因参与ATP结合和DNA修复；细胞组分则集中于胞质和核过程。下调基因则与细胞增殖、信号转导和转录调控相关，提示TE组织存在再生能力受损和免疫平衡改变。

基因-生物过程网络分析突出显示了CD96、GZMA和CORO1A等基因与免疫过程的紧密关联，包括NK细胞介导的免疫、白细胞脱颗粒和淋巴细胞活化。CORO1A与NK细胞应答强烈相关，CD96参与白细胞脱颗粒，GZMA涉及溶细胞活性。进一步网络分析揭示了NK细胞脱颗粒、淋巴细胞介导的细胞毒性和T细胞增殖等免疫活化过程的富集，表明TE组织中免疫动态发生变化，尤其是NK和T细胞功能。PRF1、NKG7和CD3E等基因显著参与溶细胞通路，提示TE可能存在免疫效应活性增强和免疫调节改变。

3.2 单细胞RNA-seq分析

scRNA-seq数据质控后，通过UMAP注释识别出B细胞、淋巴细胞、单核细胞和基质细胞等免疫细胞亚群。TE组织中B细胞和单核细胞富集，表明存在促炎微环境；而对照样本显示更稳定的免疫谱。UMAP降维识别出11个 distinct 细胞群体，TE样本中免疫和基质细胞群体增加，上皮细胞分布更均匀，提示免疫微环境改变和细胞重塑。t-SNE可视化进一步支持了TE中免疫相关细胞类型的富集和结构变化。

跨数据集验证发现CORO1A、GNLY和GZMA在bulk和单细胞数据中均显著上调，主要表达于上皮和免疫细胞簇。尽管经典衰老标志物如CDKN2A/p16和CDKN1A/p21未差异表达，但免疫调节基因如CORO1A、GNLY和GZMA可能参与组织重塑相关的免疫应答。scRNA-seq的GO分析显示，TE中差异基因富集于 extracellular matrix（ECM）组织、细胞粘附和ATP代谢等过程，表明ECM相关术语提示动态但可能受损的重塑。基底膜和细胞-基质接触相关基因的富集支持了组织结构改变。分子功能方面，TE相关基因富集于胶原和微管结合活性，反映细胞骨架重塑和 possible 纤维化；对照组织则富集于ECM结构和 redox 运输，表明稳定的代谢和结构稳态。

3.3 qPCR验证差异基因表达

qPCR验证证实CORO1A、GNLY和GZMA在TE组织中表达显著上调：CORO1A表达量约为对照的2.5倍（p<0.01），GNLY为3.1倍（p<0.01），GZMA为2.8倍（p<0.01）。扩增曲线和熔解曲线显示高效且特异的 amplification。箱形图和小提琴图可视化表明显著且一致的表达差异（p<0.001），支持这些基因在TE免疫景观中的关键作用。

讨论

薄型子宫内膜（TE）是女性生殖健康中的重要问题，与不孕、反复流产和不良妊娠结局相关。内膜在月经周期中经历增生、分泌和脱落等复杂过程，对成功受精和胚胎植入至关重要。TE通常定义为内膜厚度小于7毫米，与内膜修复和再生能力受损有关。尽管临床研究众多，但TE发展的分子机制及细胞衰老调控仍知之甚少。

高通量测序技术的应用显著增进了对子宫内膜等组织中基因表达变化的理解，允许识别内膜修复、再生和衰老中的关键调控基因。本研究通过RNA测序 investigate TE组织中的基因表达，聚焦于潜在分子调节因子。结果提示CORO1A、GNLY和GZMA等基因在TE的免疫应答调节、细胞迁移和组织重塑中发挥重要作用。这些发现至关重要，因为它们表明失调的细胞过程，如改变的免疫活化和炎症应答，可能 contribute to TE发展并损害组织再生。

CORO1A作为TE组织中显著上调的基因，突显了其在TE病理生理中的潜在重要性。CORO1A参与肌动蛋白动力学和免疫细胞迁移，通过支持T细胞和自然杀伤（NK）细胞中细胞骨架蛋白的结构完整性和功能，在调节免疫应答中起关键作用。CORO1A表达上调可能增加免疫细胞浸润，潜在地改变子宫内膜局部免疫环境并 disrupt 其再生能力。同时，GNLY和GZMA的上调，作为NK和细胞毒性T细胞活性的关键介质，提示增强的溶细胞免疫谱。这些基因 contribute to 免疫介导的细胞清除机制，其表达增加可能反映 attempt to 消除子宫内膜内的损伤或 dysfunctional 细胞。然而，这类应答的持续活化也可能损害组织恢复并加剧TE中的结构缺陷。

这些基因的上调在bulk RNA-seq、单细胞RNA-seq和qPCR实验中一致验证，增强了发现的稳健性。既往研究将CORO1A、GNLY和GZMA与免疫监视和细胞毒性应答相关联，尤其在炎症和纤维化疾病中。尽管数据未建立直接因果关系或功能效应，但它们突出了可能伴随或影响TE病理的转录特征。这些基因可能反映TE中的免疫活化状态，并为未来生物标志物发现或治疗研究提供初步线索，有待功能验证。免疫活化是 precedes and contributes to TE发展，还是由于组织变薄而产生，仍不明确，这一问题需要 further 纵向和机制研究。

TE的分子机制多面，可能涉及免疫细胞、 extracellular matrix 和子宫内膜上皮或基质细胞之间的复杂相互作用。本研究结果 contribute to 越来越多的证据表明免疫失调和异常组织重塑是TE的关键特征。CORO1A、GNLY和GZMA的上调因而可能反映免疫相关扰动而非TE的直接驱动因子，但它们为 further 机制研究提供了有希望的线索。

研究存在 several 限制。首先，转录组数据提供基因表达见解但未确认蛋白水平功能。未来研究应包括Western blotting或 immunohistochemistry 以确认鉴定基因的翻译和定位。其次，相对小的样本量限制这些发现的普遍性。更大队列和动物模型 necessary to 验证结果并确定其生物学相关性。此外，CORO1A、GNLY和GZMA在TE中的功能角色应使用体外 assay 和扰动实验 investigate，以澄清它们是否因果 contribute to 组织重塑或免疫 dysfunction。

总结来说，研究突出了CORO1A、GNLY和GZMA在薄子宫内膜组织中的上调，并提示这些基因可能参与与 impaired 组织再生相关的免疫相关通路。这些结果提供分子见解，可能为未来生物标志物发现和治疗靶向提供信息，以改善子宫内膜容受性和生育结局。样本量相对小 due to 严格纳入/排除标准和获取高质量、周期匹配的子宫内膜组织的困难。因此，发现应视为探索性和假设生成。未来涉及更大规模和纵向队列的研究将需要验证这些转录组特征并提高普遍性。