微管相关蛋白2（MAP2）缺失导致高频听力损失的机制研究及其在耳蜗毛细胞维持中的关键作用

《Frontiers in Audiology and Otology》：Microtubule-associated protein 2 (MAP2) deficiency causes high-frequency hearing loss

本研究发现微管相关蛋白2（MAP2）缺失通过破坏耳蜗毛细胞（特别是外毛细胞OHCs）的结构完整性，导致进行性高频听力损失。研究通过听觉脑干反应（ABR）和免疫组化分析证实，MAP2在耳蜗基底区域高表达，其缺失引起OHCs数量减少和听觉敏感性下降，为遗传性听力障碍提供了新的分子机制解释。

　　

1 引言

听力损失是全球最常见的感官障碍，影响约5%的人口。遗传突变导致的听力损失占非综合征性听力障碍病例的一半，目前已发现超过100个致病基因。这些基因主要涉及内耳发育、毛细胞细胞骨架、细胞粘附、细胞内运输等功能。值得注意的是，约20%的遗传性听力损失病例仍病因未明，表明存在大量未知的遗传因素。

听觉系统将机械振动转化为电生理反应的过程高度依赖于耳蜗毛细胞独特的细胞骨架结构。内耳毛细胞是高度分化的极化上皮细胞，其顶端表面具有静纤毛束。静纤毛由排列整齐的丝状肌动蛋白（F-actin）及相关蛋白构成，插入并受交叉连接的F-actin致密网络（即表皮板）和微管网络的支持。由于正常听觉需要感知比静纤毛直径小得多的纳米级机械运动，毛细胞的细胞结构完整性至关重要。

微管是由α/β-微管蛋白组成的管状聚合物，具有称为动态不稳定性的结构灵活性。微管稳定性受多种结合因子调节，包括微管相关蛋白（MAPs）。其中MAP2作为重要的磷蛋白，在成熟神经元的胞体和树突中特异性表达。它通过与微管结合，参与其聚合和稳定化过程，在树突中还能结合蛋白激酶（如PKA）并将其定位至树突，从而调节微管动力学并贡献于神经元形态变化。

除神经元外，MAP2在耳蜗毛细胞（包括人类和大鼠）中也有表达。近期研究表明MAP2可与构成耳蜗毛细胞静纤毛核心结构的肌动蛋白相互作用。基于这些证据，研究者提出MAP2在听觉功能中发挥作用的假设，并通过Map2基因敲除小鼠模型进行了验证。

2 材料与方法

研究使用4周和16周龄的雄性C57BL/6J野生型（Map2^+/+）和Map2纯合敲除（Map2^?/?）小鼠。选择雄性小鼠是因为先前研究发现雄性对听力损失具有更高易感性。

听觉脑干反应（ABR）测量在隔音室中进行。动物使用三种混合麻醉剂麻醉，体温维持在约37°C。声音刺激使用MATLAB生成，采样频率192kHz，采用10个频率（2-72kHz）进行ABR测量。通过放置在 inferior colliculus（记录电极）、motor cortex（参考电极）和右头皮肤（接地电极）表面的三个电极记录ABR。波V的峰值潜伏期（PL）离线测量计算。

耳蜗全mount免疫染色采用已建立的标准方案。使用兔多克隆抗myosin VIIa抗体和鸡多克隆抗MAP2抗体进行染色，荧光图像使用LSM 700 Zeiss共聚焦显微镜捕获。根据位置-频率映射图，估计耳蜗各转对应的频率范围：顶转、中转和基转分别对应4.8-14.8、14.8-34.1和34.1-78.8kHz。

螺旋 ganglion神经元（SGNs）的苏木精/伊红（HE）染色采用相同灌注方案，整个小鼠头部用22.5%甲酸、10%柠檬酸和2%NaOH水溶液脱钙7天。标本脱水、透明后石蜡包埋，切片厚度6μm，HE染色后使用光学显微镜成像。

3 结果

3.1 MAP2缺失导致听力敏感性降低

通过测量野生型（Map2^+/+）和Map2纯合敲除（Map2^?/?）小鼠的听觉脑干反应（ABRs），发现16周龄Map2^?/?小鼠表现出具有频率特征的反应阈值升高。Map2^?/?小鼠的ABR阈值在4-32kHz范围内高于Map2^+/+小鼠，在16kHz处最大增加30dB。在50kHz以上，即使使用最响亮刺激（90dB SPL），Map2^?/?小鼠也未观察到ABR反应。

4周龄时，两组间听力阈值无显著差异。Map2^?/?小鼠波V峰值潜伏期随声压级降低准线性增加，而Map2^+/+小鼠在65dB SPL以下开始趋于平稳，表明Map2^?/?小鼠对弱声的波V潜伏期非线性特征丧失。这些结果表明Map2^?/?小鼠表现出进行性高频听力损失，这是感觉神经性听力损失的典型特征。

3.2 MAP2定位于OHCs和IHCs

通过耳蜗全mount免疫荧光染色确定MAP2在耳蜗毛细胞中的定位。抗MAP2抗体标记了耳蜗神经节神经元以及耳蜗顶、中、基转的毛细胞。野生型小鼠中MAP2荧光强度随耳蜗转位变化，基转强度最高，顶转最低。高倍镜观察显示内外毛细胞均表达MAP2，这些荧光信号在Map2^?/?小鼠耳蜗中消失。

MAP2似乎在整个OHCs和IHCs的细胞体中表达。F-actin标记物phalloidin强烈标记静纤毛和表皮板，同时标记细胞连接处并弱标记细胞质。

3.3 MAP2缺失减少内耳OHCs数量，对应高频波段

为探究MAP2缺失导致的听力损失是否由毛细胞存活率降低引起，通过myosin VIIa（毛细胞标记物）免疫染色确定耳蜗各转毛细胞数量。Map2^?/?小鼠耳蜗基部OHCs数量减少约35%。在耳蜗基区以外的OHCs区域或任何区域的IHCs中，Map2^+/+和Map2^?/?小鼠间无差异。

3.4 MAP2缺失不影响SGNs形态和密度

研究调查了MAP2缺失是否影响螺旋神经节神经元（SGNs）形态。16周龄Map2^?/?小鼠的SGNs保持与野生型小鼠相同的细胞密度和形态，未观察到小胶质细胞等非神经元细胞浸润。

4 讨论

本研究通过体内实验证明MAP2缺失导致听力障碍。具体而言，记录ABR生成的听力图显示，16周龄Map2^?/?小鼠相比同龄Map2^+/+小鼠听力敏感性降低，尤其在高频范围。随着刺激频率降低，差异减小并在2kHz频率处变得统计不显著。

C57BL/6小鼠已知从约12周龄开始出现年龄相关性听力损失。在本研究条件下，Map2^+/+小鼠未观察到高频ABR阈值升高，但Map2^?/?小鼠出现显著听力损失，表明MAP2缺失可能增加高频范围的易损性。这一解释与4周龄Map2^?/?小鼠未表现出明显听力损失的观察一致。影响感觉毛细胞易损性的因素可能决定听力损失的发病时间。

感觉神经性听力损失表现为频率依赖性或声学特征依赖性的听力敏感性下降。Map2^?/?小鼠观察到的频率依赖性听力损失属于感觉神经性听力损失范畴。此外，在典型传导性听力损失中，听力损伤的潜伏期-强度函数预期从正常听力向上平移，与听力损失程度成比例。然而波V的潜伏期-强度函数显示，Map2^+/+和Map2^?/?小鼠间的潜伏期差异随刺激强度降低而增加。总体而言，Map2^?/?小鼠的ABR反应与感觉神经性听力损失症状不矛盾，表明MAP2缺失破坏了耳蜗功能和/或中枢听觉通路。

耳蜗基转毛细胞相比顶转对应物表现出更大的内在易损性，这一现象在各种损伤中均有观察到，包括耳毒性药物、声学过度刺激和年龄相关性退化。这种音调易损性梯度在器官型培养模型中得到重现，其中基转毛细胞始终对多种应激源表现出更高敏感性。 several基因已报道显示与这种易损性梯度相关的音调梯度模式。

值得注意的是PKHD1L1，定位于耳蜗毛细胞尖端并在最常暴露于声音机械应力的高频区域富集。Pkhd1l1基因缺失导致进行性听力损失，表明其表达提供保护作用。本研究中，毛细胞MAP2荧光强度也表现出清晰的音调梯度，基转值最高，顶转值最低。尽管这种模式的功能意义尚不清楚，但MAP2可能与PKHD1L1类似，有助于抵抗损伤。鉴于MAP2参与细胞骨架组织，其在基区的较高表达可能支持结构完整性和机械应力抵抗。

此外，耳蜗染色显示MAP2在IHCs和OHCs中均有表达。先前研究报道MAP2c（MAP2的一种亚型）在IHCs和OHCs中均有表达，且在OHCs细胞体边界（近静纤毛根部）比IHCs分布更密集，但细胞质中荧光强度无显著差异。本研究使用的抗体与所有MAP2亚型反应，因此无法区分亚型，但很可能是MAP2c荧光。MAP2与phalloidin共染色显示MAP2荧光存在于OHCs和IHCs的细胞质中。已知MAP2c与肌动蛋白（静纤毛和表皮板的主要成分）交联和捆绑。尽管MAP2在毛细胞功能中的确切作用尚未确定，但其在毛细胞中的选择性表达表明MAP2在这些细胞的维持和/或功能中发挥关键作用，这可以解释Map2^?/?小鼠的听力损失。

MAP2缺失减少耳蜗基转OHCs数量，表明MAP2是OHCs维持的重要蛋白。由于基转OHCs被认为最易受声音刺激机械应力影响，基转OHCs的选择性减少表明MAP2可能在机械应力抵抗中发挥作用。这一假设得到我们观察到的MAP2在表皮板（声创伤主要影响的细胞结构之一）中表达的部分支持。

然而，Map2^?/?小鼠的听力敏感性不仅在对应基转的高频范围（约34.1-78.8kHz）显著降低，在对应中转和基转的相对低频范围（34.1kHz以下）也降低，这些区域未观察到细胞数量差异。这种差异表明MAP2缺失引起的听力敏感性降低不能 solely归因于毛细胞损失。由于技术限制，我们未探讨存活的MAP2缺陷毛细胞是否具有正常生理功能。然而，如果毛细胞中的MAP2通过与F-actin相互作用贡献于静纤毛的机械特性（如刚度），MAP2缺失可能同时影响机械转导（即ABR敏感性）和对机械应力的易损性（即OHCs减少）。这一假设与 several发现一致，即影响静纤毛机械特性的遗传突变可导致听力损失。因此，毛细胞（特别是OHCs）对MAP2缺失特异性易损，这些细胞的损失可能是Map2^?/?小鼠频率依赖性听力损伤的原因之一。

耳蜗毛细胞表现出独特的结构特化，包括静纤毛。MAP2可能参与这些结构特征。例如，IHC的带状突触是独特的结构特征，噪声暴露引起的损失和动态变化导致听力损伤（称为隐藏性听力损失）。MAP2结合并支持F-actin和微管的功能，这些在细胞运动、轴突生长和细胞器/蛋白质向生长锥运输中发挥关键作用。在突触前末梢，F-actin和微管参与突触囊泡的快速/慢速补充。尽管MAP2缺失未减少IHCs数量，但可能损害这些系统，从而阻碍带状突触的正常功能。MAP2缺失也可能破坏IHCs的突触输出。微管蛋白在IHCs和OHCs中均有表达，微管束平行于细胞纵轴运行。鉴于MAP2调节微管稳定性和动力学，其遗传缺失预期会破坏微管网络并阻碍细胞内囊泡运输朝向毛细胞的基底突触极，从而减弱其输出。总体而言，MAP2在静纤毛以外毛细胞中的作用在本研究中未充分考量，应作为未来研究重点。

同样重要的是考虑MAP2缺失可能比耳蜗更影响近端听觉神经通路。MAP2及其旁系同源物与微管结合并调节其长度，从而贡献于细胞形态和物质运输。其对正常神经功能（包括神经发育）的潜在贡献仍知之甚少。然而，合理考虑MAP2轻微但明确地影响听觉神经通路功能，从而产生涉及Map2^?/?小鼠ABR波V的听力损失表型。实际上，声暴露后ABR波V振幅降低反映小鼠突触功能障碍，Map1b（编码与MAP2密切相关的蛋白质并与MAP2发挥互补作用）缺陷据报道由于螺旋神经节神经元功能障碍导致听力损失。我们还发现Map2^?/?小鼠未显示SGN形态改变；然而，SGNs直至下丘（波V主要来源）的其他听觉通路的神经功能值得研究。

据报道，在39%的听力损失患者中鉴定出49个不同基因的致病变异，表明听力损伤的遗传基础大部分仍不清楚。根据近期综述，120个基因已知与听力损伤相关，其中大量基因涉及内耳毛细胞的细胞骨架变化。人类中存在众多Map2变异，可能贡献于听力损伤的遗传基础。未来研究需进一步调查Map2突变如何影响临床耳聋病例。

总之，我们的研究表明编码微管相关蛋白的Map2缺陷导致OHCs损失，引起高频听力损失。这些发现为毛细胞损伤导致的听力损失病理生理学提供见解，并有望贡献于治疗干预措施的开发。