维生素D信号通路在桥本甲状腺炎中的失调：一项基于韩国人群的整合转录组学研究

本研究发现桥本甲状腺itis（HT）患者血清维生素D水平显著降低，但甲状腺组织中维生素D受体（VDR）表达及维生素D相关生物过程（BP）基因显著上调。通过RNA测序和生物信息学分析，揭示了维生素D信号通路在HT中的多层面调控，为维生素D作为HT潜在治疗靶点提供了分子依据。

　　

背景：桥本甲状腺炎（HT）是发达国家导致甲状腺功能减退的最常见甲状腺疾病。近期研究强调维生素D因其免疫调节作用可能作为HT的潜在风险因素或治疗剂，但具体证据尚未呈现。这项回顾性观察研究旨在调查HT患者血清维生素D水平及维生素D信号通路的失调情况。

方法：研究招募了因各种甲状腺肿瘤伴或不伴HT而接受甲状腺手术的患者。分析了HT患者的血清甲状腺生物标志物，包括血清维生素D、抗甲状腺球蛋白（TG）抗体和抗甲状腺过氧化物酶（TPO）抗体。利用RNA测序技术，研究了甲状腺组织的基因表达谱以及HT与维生素D水平或其信号传导之间的潜在相关性。

结果：HT患者血清维生素D水平显著降低。然而，HT组中维生素D受体（VDR）表达及参与维生素D相关生物过程（BP）的基因显著上调。在Wikipathways上对表达谱的可视化揭示了HT组维生素D相关通路的多层面调控。实时荧光定量PCR和免疫荧光染色证实了HT队列甲状腺组织中VDR表达的增强。

结论：本研究呈现了从韩国HT队列中获得的RNA测序数据，并强调了HT队列甲状腺组织中维生素D信号的失调。需要进一步研究以阐明维生素D信号在HT发病机制中的因果作用。

方法

研究受试者与甲状腺组织收集

本研究依据延世Severance江南医院机构审查委员会（IRB）进行（IRB批准号：3-2023-0068）。研究遵循《赫尔辛基宣言》（2013年修订）及当地法规。向参与者提供了研究目标和程序的信息，所有参与者在研究前均签署知情同意书。招募时间为2023年7月5日至2024年12月6日，符合各种甲状腺肿瘤手术资格的患者被纳入，这些肿瘤包括乳头状甲状腺癌（PTC）、滤泡性腺瘤、甲状旁腺腺瘤、具有乳头状核特征的非浸润性滤泡性甲状腺肿瘤、髓样甲状腺癌、未分化甲状腺癌和腺瘤样增生，诊断基于影像学发现和细针穿刺（FNA）获取组织的组织病理学分析。为比较临床特征，仅将经组织病理学确诊为HT的女性患者纳入HT组。基线时未评估维生素D补充剂和左旋甲状腺素治疗的使用情况。研究设计流程图见图1。甲状腺部分和全切除术后收集的组织转移并储存于-80°C。这些组织用于RNA测序、组织学分析和维生素D相关标志物的实时聚合酶链反应（PCR）。

临床参数分组

本研究共纳入197名患者。诊断为桥本甲状腺炎的患者被分配至HT组（n=87），无桥本甲状腺炎的患者（n=110）被分配至NT（正常甲状腺）组。临床比较仅纳入女性患者，以减少基于性别的变异性，因为HT中女性占主导地位已得到充分证实。未进行正式的功效计算，因为本研究是回顾性的，可用样本量由预先存在的临床数据和生物样本可用性决定。患者维生素D与血清TG水平相关性的线性回归在R studio中使用ggplot2包进行可视化。使用密度图和直方图描述两组（HT和NT）的临床特征以及每组中TG抗体水平的分布。创建了带有线性回归的散点图来描述两个变量（TG和血清维生素D水平）之间的相关性。

差异表达基因筛选与生物信息学分析

共招募18例伴或不伴HT的PTC患者的组织用于RNA测序分析。甲状腺RNA测序和基因表达水平分析的详细过程在补充信息中描述。生成的RNA测序数据集已存入Gene Expression Omnibus（GEO），登录号为GSE 286332。数据质量检查和标准化由Macrogen Inc.（韩国首尔）遵循标准化方案进行。使用DESeq2包进行DEG分析。统计学显著性基于调整后的p值和log2倍数变化确定。错误发现率（FDR）通过使用Benjamini-Hochberg算法调整p值进行控制。DEGs的选择阈值是调整后p值 < 0.05 且 |log2倍数变化| > 1。

使用gProfiler或R中的clusterprofiler带有注释包，对显著BP术语和KEGG通路进行富集分析和GSEA。使用gseGO和gseKEGG功能，该包分析所有按倍数变化排序的基因，以输出调整后p值和标准化富集分数（NES）的BP术语和KEGG通路。鉴于样本量有限，RNA测序分析设计为探索性研究，旨在识别潜在的差异表达基因和富集通路，而非提供确定性结论。

维生素D相关Wikipathway基因表达谱可视化

从RNA测序数据中收集基因表达数据。使用Cytoscape（版本3.10.1）将基因表达谱（倍数变化）纳入生物通路。在WikiPathways列出的各种生物通路中，仅包括与维生素D信号传导和代谢直接相关的通路进行富集分析，而不相关的通路被排除。使用“Wikipathways”Cytoscape应用程序加载各种维生素D相关的Wikipathways，包括“1,25-二羟基维生素D3的非基因组作用”、“维生素D受体通路”、“炎症性疾病中的维生素D”和“维生素D代谢”。导入并将基因表达图作为通路中所有基因的属性附加后，通过着色（红色高表达，蓝色低表达）可视化基因表达水平。

维生素D相关BP术语中包含基因的整合分析

使用AmiGO2搜索维生素D相关的BP术语。使用维生素D作为搜索查询搜索GO术语，并在“生物体”字段中将过滤器设置为“智人（Homo sapiens）”。将所得的BP术语和BP的基因识别为基因符号，并与从RNA测序获得的原始表达数据进一步比较。

使用实时PCR确认VDR基因表达

使用TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific，美国）从甲状腺组织中分离总RNA。使用AccuPower RT PreMix（Bioneer，韩国大田）和oligo (dT) 18引物（Invitrogen，美国卡尔斯巴德）进行逆转录。使用LightCycler 480 PCR系统（Roche，瑞士巴塞尔）进行cDNA扩增。PCR步骤如下：初始变性步骤（95°C 10分钟），45个扩增循环（95°C变性10秒，56°C（VDR）和62°C（GAPDH）退火20秒，72°C延伸30秒）。通过将基因Ct值除以GAPDH的Ct值来计算相对表达水平。人维生素D受体（VDR）和GAPDH的引物序列：人VDR F 5’-CTGACCCTGGAGACTTTGAC-3’, R 5’-TTCCTCTGCACTTCCTCATC-3’；人GAPDH F 5’-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3’, R 5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’。

组织病理学与免疫荧光染色

将固定在甲醛溶液（JUNSEI，日本京都）中的人甲状腺组织石蜡包埋，并使用Leica切片机（RM2235，德国努斯洛赫）切成5微米切片。对于苏木精和伊红（H&E）染色，切片在二甲苯中脱蜡，通过梯度乙醇系列再水化，并用苏木精染色以显示细胞核。用自来水冲洗后，将切片短暂浸入伊红溶液中以染色细胞质和细胞外基质。对于免疫荧光染色，切片脱蜡、再水化，并通过在柠檬酸盐缓冲液中100°C加热10分钟进行抗原修复。然后将其在含有2% BSA、2%山羊血清和0.1% Triton X-100的PBS封闭溶液中孵育30分钟。随后，载玻片与单克隆VDR (D-6)抗体（1:100；SANTA CRUZ，目录#sc-13133，美国加利福尼亚州）孵育过夜。PBS洗涤后，用DAPI（100 μg/mL）复染细胞核。最后，所有切片使用VectaMount介质（Vector Laboratories，美国伯林格姆）封片。使用配备DP73相机（Olympus）的BX53显微镜（Olympus，日本东京）检查和拍摄染色切片。

统计学分析

使用未配对Student t检验（双尾）分析组间临床特征和VDR基因表达的统计学差异。结果以平均值±标准差（SDs）表示，p值 < 0.05被认为具有统计学显著性。所有统计分析均使用GraphPad Prism软件（版本5.0；GraphPad Software，美国拉霍亚）进行。使用R中的lm()函数构建线性回归模型，并在p值 < 0.05时评估显著性。在G*Power（版本3.1.9.7）中计算独立样本t检验的事后功效；报告了标准化效应大小（Cohen’s d）和95%置信区间。

结果

总研究队列基线特征

197名患者的临床特征见表1。患者年龄（岁）和血清T4、TSH、PTH水平无显著差异（p > 0.05），而作为HT主要临床特征的抗TG和抗TPO抗体水平在HT组显著升高（p < 0.05）。此外，HT组血清维生素D水平显著较低（25.57 ± 10.89 vs. 22.48 ± 9.22 ng/mL，平均差 = 3.09 ng/mL，95% CI: 0.26–5.92, p = 0.033）（表1，图2A）。事后功效为0.556（α = 0.05）。还研究了抗TG抗体水平与维生素D水平之间的相关性。HT和NT患者维生素D水平的密度图显示两组分布存在差异（图2B）。抗TG水平的直方图显示每组抗TG水平分布存在明显差异（图2C）。此外，显示了两个参数（维生素D和抗TG水平）之间带有线性回归的散点图（图2D）。相关性分析显示，在HT组和NT组中，甲状腺球蛋白（TG）水平与维生素D水平均存在统计学上显著的负相关。该模型显示R2为0.0248（p = 0.0286），表明解释力较弱，但具有一致的统计学显著性。

虽然抗TG和抗TPO抗体都是HT的重要标志物，但由于其在队列中的完全可用性及其在某些组织背景下与HT的更高特异性，选择抗TG进行与维生素D的个体水平相关性分析（散点图）。一部分患者的抗TPO数据不可用，因此未包含在个体水平可视化（散点图）中。

RNA测序分析研究队列特征及RNA测序质量控制和数据标准化

补充表1显示了其甲状腺组织用于RNA测序的患者的临床特征。补充图1代表了质量控制和数据标准化的数据。每个图的详细描述可在补充文件中找到。

基于DEG的GO和KEGG富集分析代表HT的一般表型

补充表2显示了按Log?(FC)排列的前12个上调和下调的DEGs。MS4A1、P2RX5、BLK、NIBAN3和POU2AF1呈现为前五个上调基因。IFI6、SLC6A15、MYOC、IFIT1和PRKG2呈现为前五个下调基因。

此外，当用DEGs分析富集的BP术语时，提出了T细胞介导的免疫相关BP术语，特别是在自身免疫性甲状腺疾病中指定的术语，包括“淋巴细胞激活的调节”、“T细胞激活的调节”、“单核细胞分化”和“免疫反应调节信号通路”（补充表3）。此外，当用DEGs分析富集的BP术语时，识别了T细胞介导的免疫相关BP术语，特别是在自身免疫性甲状腺疾病中指定的术语，包括“淋巴细胞激活的调节”、“T细胞激活的调节”、“单核细胞分化”、“免疫反应调节信号通路”和“细胞间粘附的调节”（图3A）。显著BP和KEGG通路的GSEA图揭示了HT的临床特征，具有明确的与淋巴细胞激活、自身免疫性甲状腺疾病（激活）和甲状腺激素生成（失活）相关的偏斜基因表达谱（图3B-D）。按NES排列的显著上调BP术语和KEGG通路列表见补充表3。

维生素D相关反应在HT中高度上调

我们进一步研究了HT队列中维生素D相关通路及其信号传导的变化。进一步研究了维生素D反应（GO:0033280）的BP，以确认每个患者的表达水平（图4A）。层次聚类热图显示，大多数HT个体的与BP术语相关的基因表达水平升高，每个表型有孤立的个体。BP术语“对维生素D的反应”的GSEA图揭示了激活的基因表达谱（图4B）。

通过Wikipathway可视化维生素D相关通路的调控

使用独特的颜色对每个“Wikipathways”中的基因进一步可视化基因组表达谱（图5A-D）。在“维生素D受体通路”中，异源二聚体VDR/RXR复合物转录因子调节的成员基因的表达模式被单独控制（图5A）。维生素D的非经典、非基因组信号传导是指快速激活细胞内信号分子，如PKC、MAPK和PI3K/Akt，不依赖于核维生素D受体（VDRn）的基因组转录。HT组中几个信号通路中的基因被显著调节（图5B）。“抗病毒基因转录”中的聚类基因（左下角）在HT中显示一致的下调。由细胞应激和细胞因子诱导的促炎信号分子和主要转录因子，包括MAPK和NF-kB，同时上调（图5C）。PPP3CA和PPP3R1，它们是钙调神经磷酸酶的调节亚基，参与T细胞介导的免疫反应，被上调（图5C）。对“维生素D代谢”通路的分析揭示了参与维生素D代谢（CYP24A1）或生物激活（CYP27B1）的基因表达增强（图5D）。

参与维生素D相关BPs的基因在HT中发生改变

在人类BP术语中搜索维生素D揭示了来自AmiGO数据库的六个术语（维生素D生物合成过程、维生素D代谢过程、对维生素D的反应、维生素D受体信号通路、细胞对维生素D的反应、维生素D分解代谢过程）。根据它们在RNA测序表达数据中的表达水平，研究了参与维生素D相关BP术语的基因（表2）。在我们原始表达谱数据中确认的18个基因中，有8个基因发生显著改变，并且在HT患者中全部上调。HT组中下调的基因均无统计学显著性。

免疫组织化学检查显示组织中VDR高表达

为了使用维生素D验证这些结果，我们对甲状腺组织进行了实时PCR和组织病理学染色。每组八个样本的实时PCR显示HT组VDR基因表达显著上调，这与RNA测序数据一致（补充图2）。组织学检查显示NT组织（左侧）中滤泡结构正常，无异常变化，而HT组（右侧）显示甲状腺组织结构边界弥散（图6A）。强化的H&E染色显示HT组织中免疫细胞浸润增加，这是桥本甲状腺炎的常见临床特征（图6A）。此外，在HT甲状腺组织中通过VDR抗体偶联证明了增强的荧光强度（图6B）。

讨论

据报道，几种环境和基因组因素在HT的发展中起作用。此外，微量营养因素（包括碘、硒和维生素）与HT发生之间的深层相关性已得到认可。而且，营养因素基于食物可得性和周围环境具有区域特征。根据2008年进行的韩国国民健康与营养 examination调查（KNHANES），韩国人群中的维生素D缺乏是一个普遍问题，在女性中比男性更常见。这种现象可能对该人群的自身免疫相关状况产生根本性影响。HT队列显示血清维生素D水平（尤其是25(OH)维生素D）显著较低（表1）。

已经进行了调查维生素D水平与自身免疫性甲状腺疾病之间关联的研究。先前的一项研究揭示了韩国人群中低维生素D水平与HT之间的关联。该研究根据甲状腺功能减退表型对HT患者的严重程度进行了分类：甲状腺功能正常（ET）、亚临床甲状腺功能减退（SCH）和显性甲状腺功能减退（OH）。将维生素D水平与非AITD组比较，OH组显示维生素D水平显著较低（99.6 ± 53.7 vs 80.1 ± 47.7; p = 0.010）。相反，一项以表型为中心的病例对照研究显示HT患者维生素D不足的患病率显著较高。一项全国性的基于调查的研究阐明了女性甲状腺自身抗体或甲状腺功能障碍与维生素D不足之间的潜在联系。在我们的研究中，在所有参与者（包括统计