HFTC：基于低维嵌入特征和层次随机森林的真菌ITS序列分类新方法

本研究提出HFTC（层次真菌分类模型），通过双向k-mer策略和Word2Vec嵌入将特征维度从4k降至200维，结合多层次随机森林（RF）架构解决真菌ITS序列分类中高维特征和分类不一致性问题。实验显示HFTC在ACC（95.25%）、MCC（95.31%）和层次准确性（HA，95.10%）上均优于主流工具（Mothur、RDP、Sintax等），且推理速度最快（0.37ms/序列），为微生物组研究提供了高效可靠的分类方案。

　　

1 引言

真菌在地球生态平衡和人类生活中扮演着不可或缺的角色，涉及生物多样性保护、有机物分解、医药食品生产和农业生物防治等多个领域。尽管其生态和生物技术意义重大，但真菌的探索仍严重不足——估计约1200万种真菌中仅有15万种被正式描述。传统基于形态学的鉴定方法在缺乏形态特征时难以应用，而全基因组测序又成本高昂、计算密集。因此，DNA宏条形码技术成为微生物群落分析的主流方法，其中ITS（Internal Transcribed Spacer）区域被确立为真菌的通用DNA条形码。

ITS序列分类面临三大挑战：高维特征表示带来的计算负担、分类噪声与数据不平衡问题，以及扁平分类模型导致的层次预测不一致。现有方法（如BLAST、k-mer频率向量）虽具有一定准确性，但特征维度高达4^k（k通常为7–11），且无法保证跨分类层级的一致性预测。例如，一个在门水平分类错误但在属水平分类正确的序列，在单层级评估中仍会被计为正确，从而夸大模型性能。

2 材料与方法

2.1 数据提取与预处理

研究基于UNITE数据库（v9.0）构建高质量ITS数据集。原始数据包含6,499,364条序列，经过严格过滤：剔除132万余条未鉴定或模糊标签序列、6.6万余条含非标准碱基的序列，以及29.5万余条来自物种假设（SH）代表序列少于10条的稀有分类群。最终训练集包含251,630条序列，代表25,163个真菌物种，每个SH随机抽样10条序列以平衡数据分布。测试集完全独立于训练集，按每物种10–30条序列构建五个子集（Test10–Test30）。

2.2 序列特征表示

HFTC采用双向k-mer（Bi-kmer）策略和Word2Vec嵌入进行特征工程。将ITS序列视为“句子”，k-mer作为“单词”，通过滑动窗口（步长L）提取正向和反向k-mer。使用Skip-gram模型（而非CBOW）训练Word2Vec，以更好捕捉稀有k-mer的上下文信息。每个k-mer被映射为N维向量（N=200），整条序列通过平均池化并拼接双向向量得到2N维（400维）的紧凑表示，将特征维度从4^k（如k=7时16,384维）降至200维。

2.3 HFTC模型构建

HFTC采用层次化多级随机森林（RF）架构，从门到物种逐级分类。主要真菌门（如Basidiomycota和Ascomycota）进一步细分至纲、目、科等级别，物种数少于1000的分类群被归入“其他”类别直接进行物种分类。共构建21个子分类器，每个针对特定分类层级独立训练。RF因其对类别不平衡的鲁棒性、低计算成本和无需复杂调参而被选为基础分类器。

2.4 模型评估指标

除准确率（ACC）、召回率、精确度、F₁-score和马修斯相关系数（MCC）外，特别引入层次准确性（HA）指标：仅当样本在所有分类层级均预测正确时才计为真阳性，以全面评估分类一致性。

3 结果与讨论

3.1 子分类器划分与性能

HFTC的21个子分类器在训练和测试集上均表现稳定，17个达到95%以上准确率，最高如Fungi2p达99.98%。唯一性能较低的Cortinariaceae_f2s（准确率80.71%）源于训练数据中Cortinarius属占主导且近缘属（如Cystinarius、Hygronarius）序列相似度高，导致分类混淆。网格搜索调参未能显著提升其性能，表明问题源于数据本身而非参数设置。

3.2 特征嵌入策略优化

通过k值优化发现：高层级分类（门–科）最佳k值为10，而物种层级最佳k值为7。较长k-mer（k=10）能捕捉进化分歧带来的保守 motif，增强类间区分性；较短k-mer（k=7）对点突变和短indel更敏感，适于物种级细微变异。混合k-mer策略并未带来显著提升，故最终采用单一最优k值（高层级k=10，物种级k=7）。Word2Vec嵌入在保持准确性的同时，将特征维度降低至传统k-mer频率向量的0.3%–4.8%，大幅提升计算效率。

3.3 模型整体性能评估

在Test10数据集上，HFTC在物种级ACC达95.25%，MCC达95.31%，HA达95.10%。其余测试集（Test10–Test30）物种级准确率均高于93%。MCC在各层级均保持高位（门级99.9%，物种级95.3%），表明模型对不平衡数据具有强适应性。HFTC的ACC与HA差异仅1.60%，远低于CNN-Duong的35.00%，体现了层次架构在保证分类一致性方面的优势。

3.4 与现有分类器比较

HFTC在ACC、HA、F₁、MCC等六项指标上均优于Mothur、RDP、Sintax、QIIME2和CNN-Duong。尽管CNN-Duong物种级ACC略高（95.43%），但其HA显著降低（91.90%），且推理速度较慢（2.02 ms/序列）。HFTC凭借200维嵌入特征实现最快推理速度（0.37 ms/序列），比第二快的Sintax提速35%。QIIME2（k=7）因采用更优k值表现优于RDP和Sintax（k=8），验证了k值选择的重要性。

4 结论

HFTC通过双向k-mer、Word2Vec降维和层次RF架构，实现了真菌ITS序列的高效、准确且一致分类。其低维特征表示和快速推理能力使其适用于大规模微生物组研究。当前局限性包括对参考数据库质量的依赖、位置信息丢失问题等。未来可结合预训练语言模型（如DNABERT）增强上下文感知，或扩展至其他条形码（如16S rRNA、RPB2）。所有代码和数据已开源提供。