组织原位衍生化质谱成像技术揭示短链脂肪酸在小鼠消化道内的空间分布图谱及其与肠道菌群的共生关系

本研究报告开发了一种创新的组织原位化学衍生化结合基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）技术，成功克服了短链脂肪酸（SCFAs）易挥发的技术瓶颈。通过使用N,N,N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-胺碘化物（TMPA）和1-((二甲氨基)(二甲亚氨基)甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化物六氟磷酸盐（HATU）将羧酸转化为季胺衍生物，首次实现了对小鼠盲肠中丁酸和丙酸等微生物代谢产物的高空间分辨率可视化分析，为研究肠道菌群-代谢物空间互作提供了关键技术突破。

　　

引言

短链脂肪酸（SCFAs）是由肠道微生物产生的挥发性低分子量化合物，在维持宿主免疫稳态中发挥关键作用。由于SCFAs的高挥发性，即使使用大气压离子源的基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）技术也难以实现其组织空间分布的可视化。近年来，多种组织上衍生化方法被开发用于冷冻切片中羧基代谢物的MALDI-MSI分析，但挥发性SCFAs的检测仍面临重大挑战。

材料与方法

研究团队合成了季胺化衍生试剂TMPA，并通过高分辨质谱确认其结构。取C57BL/6NJ小鼠小肠和盲肠组织，在-20°C条件下制备10μm厚冷冻切片并固定于ITO导电玻片。切片在冷冻室中干燥2天后，于含硅胶干燥剂的50mL离心管中-80°C保存。使用iMLayer? AERO系统喷洒含TMPA（2mM）、HATU（2mM）和4-甲基吗啉（2mM）的乙腈溶液进行组织原位化学衍生化，后在乙腈饱和环境中23°C反应4小时。

分别采用1,5-二氨基萘（1,5-DAN）甲醇溶液喷雾或α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）真空升华法进行基质沉积。MALDI-MSI分析使用iMscope? QT-LCMS?-9030系统，正离子模式采集m/z 200-500范围数据，空间分辨率设置为10、25和50μm。通过组织原位MALDI-MS/MS实验验证衍生物结构，碰撞能量设置为30.0。

结果

液相反应验证显示，单羧酸与TMPA反应良好，而柠檬酸等多羧酸在现有条件下未能完全衍生化。MALDI-MS仅检测到单一位点衍生化的分子。使用1,5-DAN基质时，在m/z 242.231处出现干扰峰，影响丁酸-TMPA（理论m/z 242.223）的准确检测。改用CHCA升华基质后，干扰显著降低，成功实现内源性羧酸检测。

小鼠盲肠组织中，乳酸-TMPA分布与肠壁平滑肌区域高度重合，符合糖酵解代谢特征。丙酸和丁酸的TMPA衍生物在盲肠中强烈检测，信号分布与HE染色中上皮细胞间和未消化食物残渣间的深蓝染色区域（细菌富集区）高度一致。小肠组织中SCFAs信号极弱，与盲肠形成鲜明对比。长链脂肪酸信号对应于食物残渣分布区域，胆固醇脱水离子（m/z 369.351）则定位于肠上皮细胞。

从相同饲养环境小鼠盲肠内容物中分离出三种优势菌落：酸拟杆菌（Bacteroides acidifaciens）、鼠乳杆菌（Ligilactobacillus murinus）和乳酸球菌（Lactococcus sp002492185），经MALDI-TOF MS鉴定确认，这些菌种均具有产SCFAs能力。

讨论

本研究通过冷冻干燥结合原位化学衍生化策略，成功将挥发性SCFAs转化为季胺结合化合物，解决了传统方法中挥发性损失问题。多羧酸化合物的检测局限性表明MALDI-MS更适合单一位点衍生化分子的分析。基质选择实验证明CHCA真空升华法能有效避免副反应干扰，为SCFAs空间分布研究提供优化方案。

SCFAs分布与HE染色中细菌富集区域的高度吻合，证实了微生物来源代谢物的空间特征。小肠中SCFAs信号的缺失与生理状态下产SCFAs厌氧菌的分布规律一致。菌群鉴定结果进一步验证了SCFAs产生菌的存在，但细菌空间分布信息仍需通过荧光原位杂交（FISH）等技术与代谢物分布进行关联分析。

本研究建立的方法为阐明肠道细菌与代谢物（包括SCFAs）的空间关系提供了有力工具，未来需结合定量分析技术实现代谢物绝对定量，并通过多组学整合深入解析宿主-微生物互作机制。