姜黄来源倍半萜合酶CwTPS8与短链脱氢酶CwSDR1在姜烯酮生物合成中的功能鉴定及酵母工程应用

本研究系统鉴定并功能解析了温郁金来源的倍半萜合酶CwTPS8与短链脱氢酶CwSDR1在抗癌活性分子姜烯酮（zerumbone）生物合成通路中的关键作用。通过体外酶活验证、分子对接及定点突变技术揭示CwTPS8催化FPP生成α-姜烯（α-humulene）和β-石竹烯（β-caryophyllene）的双功能机制，并成功在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中重构de novo合成途径，为萜类化合物高效微生物合成提供关键酶元件与代谢工程策略。

　　

1 引言

姜烯酮作为一种具有显著药理活性的胡卢巴烷型倍半萜类化合物，通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制迁移与侵袭、调节免疫功能等多重机制发挥抗肿瘤作用。然而，其可持续供应受限于植物提取效率低及化学合成立体选择性复杂等瓶颈。近年来，生物合成技术为天然产物的可持续生产提供了新思路。姜烯酮的完整生物合成途径涉及α-姜烯合酶基因、细胞色素P450（CYP450）基因和短链脱氢酶/还原酶（SDR）基因的协同作用，但已鉴定的基因资源有限且催化效率不佳，严重制约了微生物细胞工厂的异源合成效率。

倍半萜类化合物在医药、食品和化妆品领域具有广泛应用。其碳骨架由法尼基焦磷酸（FPP）经倍半萜合酶环化形成，而FPP则通过甲羟戊酸（MVA）或甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径中的异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）缩合产生。倍半萜合酶家族成员包含保守的金属结合 motifs——“DDxxD” motif和“(N/D)Dxx(S/T)xxxE” motif，并根据FPP环化模式分为无环及1-6、1-7、1-10、1-11环化类型。其中，α-姜烯合酶属于1-11环化型倍半萜合酶，负责催化姜烯酮前体的生成。

短链脱氢酶/还原酶（SDR）超家族作为三大古老氧化还原酶超家族之一，具有250-350个氨基酸长度和保守的Rossmann折叠结构，包含辅酶结合 motif（TGxxxGxG）和催化 motif（YxxxK）。根据保守域和催化功能，SDR可分为经典、扩展、中间型、复杂型、发散型、非典型和未知型七种进化亚型，通过NAD(P)H依赖机制调控植物次生代谢。SDR在萜类和生物碱代谢中发挥关键作用，例如薄荷SDR催化(-)-反式异胡椒薄荷醇的立体选择性氧化，罂粟SDR催化那可汀半缩醛脱氢生成那可丁。此外，SDR还参与脂质代谢和胁迫响应通路的调控，如油棕SDR抑制饱和脂肪酸合成并增强其分解代谢，水稻SDR在胁迫下激活植物抗毒素合成，肉桂醇脱氢酶通过调控多酚合成增强抗旱性。这种功能多样性使SDR成为氧化还原调控和抗逆工程的重要工具。

为丰富姜烯酮生物合成途径的遗传资源并建立高效的微生物细胞工厂，本研究通过转录组数据挖掘和功能鉴定，成功筛选出两个关键酶：具有姜烯/石竹烯合酶活性的CwTPS8和特异性催化8-羟基-α-姜烯氧化为姜烯酮的短链脱氢酶CwSDR1，并进一步解析了CwTPS8的催化机制，在酿酒酵母中重构了姜烯酮的异源合成途径。

2 材料与方法

2.1 温郁金处理

实验所用温郁金采自浙江省温州市瑞安地区，经浙江省食品药品检验研究院郭增喜教授鉴定为道地药材。取根茎交界处约2 cm长的外植体，经表面消毒后接种于含3 mg/L 6-苄氨基嘌呤的改良MS固体培养基中，于22°C、12 h光/12 h暗的光周期人工气候室中诱导丛生芽形成。30天后，将丛生芽分离成单株并转接至MS培养基继续培养至三叶期。实验处理阶段，选取统一组培苗置于含250 μM茉莉酸甲酯（MeJA）的MS液体培养基中分别处理1小时和6小时，以不含MeJA的MS液体培养基作为空白对照组。所有处理设三个生物学重复，处理结束后迅速收集叶片样品，经液氮速冻后保存于-80°超低温冰箱。

2.2 生物信息学分析

基于转录组数据分析，从温郁金中筛选出3个萜类合酶基因和3个脱氢酶基因。通过MEGA 7软件采用邻接法（NJ）进行系统发育分析，bootstrap重复1000次，最终鉴定出一个候选α-姜烯合酶（CwTPS8）和一个短链脱氢酶（CwSDR1）。

2.3 RNA提取与基因克隆

使用植物总RNA快速提取试剂盒从MeJA处理的温郁金样品（花、叶、茎）中提取RNA，1 μg RNA经反转录试剂盒合成cDNA。根据转录组数据设计引物，通过高保真DNA聚合酶扩增CwTPS8（GenBank: PV682578）和CwSDR1（GenBank: PV682579）的完整开放阅读框（ORF），连接至B-Zero-Blunt载体并转化至大肠杆菌感受态细胞，经测序验证后保存菌种。

2.4 保守结构域与理化性质分析

使用DNAMAN软件对CwTPS8、OsTPS3、ZpTPS1、ZpTPS6和ZSS1以及CwSDR1、AtSDR1、LiBDH和SoBDH2进行氨基酸多序列比对。结果显示CwTPS8包含萜类合酶保守 motifs——“RxR”、“DDxxD”和“(N/D)Dxx(S/T)xxxE”；CwSDR1具有辅酶结合域“TGxxxGxG”和催化三联体“SYK”。通过ExPASy ProtParam工具分析其理化性质。

2.5 质粒构建

通过PCR扩增目标片段，用BamHI或EcoRI线性化pESC-Trp、pESC-Ura、pESC-Leu和pMAL-His载体，使用无缝克隆试剂盒将纯化后的片段与线性化载体连接，转化至Trans T1感受态细胞，涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，测序验证后保存。

2.6 CwTPS8蛋白纯化与体外酶反应

将重组质粒pMAL-His::CwTPS8及对照质粒pMAL-His转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导后收集菌体。使用酶缓冲液（40 mM Tris-HCl, pH 8.0; 20 mM咪唑; 250 mM NaCl）重悬细胞，冰上超声破碎，离心收集上清蛋白。通过Ni²⁺螯合柱进行纯化，用含100 mM咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白，经超滤管浓缩并换液至低温酶缓冲液（50 mM HEPES, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 5%甘油, pH 7.5）。采用BCA法定量蛋白浓度，以BSA作为标准品。酶反应体系包含纯化蛋白与FPP底物，30°C震荡孵育3小时，等体积正己烷覆盖，反应后收集正己烷相，氮气吹缩至200 μL备用。

为测定CwTPS8催化活性，将蛋白稀释至20 μg/mL，与不同浓度FPP（10-150 μM）孵育后加入EDTA终止反应，正己烷萃取三次，氮气浓缩至70 μL进行GC-MS检测。使用GraphPad Prism计算K_m和V_max值，所有数据来自三次独立实验。

2.7 CwTPS8和CwSDR1在酿酒酵母中的功能表征

将重组质粒pESC-Trp::CwTPS8及对照质粒pESC-Trp转化至酵母细胞，涂布于SD-Trp固体培养基，30°C培养3天。挑取阳性克隆接种于SD-Trp液体培养基，20小时后稀释OD₆₀₀至0.2，再培养12小时稀释至0.05，以100 mL SD-Trp葡萄糖培养基启动发酵。2天后更换为半乳糖缺陷培养基诱导3天，发酵结束后以等体积正己烷超声萃取三次，旋转蒸发浓缩，正己烷复溶后过0.22 μm有机膜，4°C保存。

2.8 姜烯酮de novo合成酵母菌株构建

基于前期构建的高FPP产量工程菌株FY94（过表达tHMG1、IDI和ERG20，下调ERG9，敲除ROX1、YJL064w和YPL062w），将重组质粒pESC-Trp::ZSS1转化至FY94获得FY94-1。随后将pESC-Leu::CYP71BA1-AtCPR导入FY94-1产生8-羟基-α-姜烯，获得FY94-2。最后将pESC-Ura::CwSDR1转化至FY94-2生成姜烯酮，获得最终菌株FY94-3。

2.9 分子对接与定点突变实验

将CwTPS8蛋白序列提交至SWISS-MODEL，以α-姜烯合酶（B1B1U3.1.A）为模板生成蛋白结构模型。通过ChewBio3D获取FPP底物3D结构，使用AutoDock Vina进行分子对接，PyMOL可视化分析。以pESC-Trp::CwTPS8为模板，采用定点突变试剂盒针对关键氨基酸进行突变，将突变载体转化至FPP高产感官酵母菌株FY95，发酵产物经10%正十二烷覆盖，双向萃取后收集正十二烷层，正己烷稀释50倍进行GC-MS定性与定量分析。

2.10 GC-MS分析

使用Agilent 8890-7000GC/TQ气质联用系统，DB-5ms毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样量1 μL。程序升温：80°C起始，以10°C/min升至240°C（保持2分钟），再以20°C/min升至260°C（保持2分钟）。电子能量70 eV，进样口温度275°C，离子源温度280°C，全扫描模式m/z范围30-350。以β-石竹烯（纯度≥95%）和柳杉二醇（纯度≥95%）为标准品，姜烯酮（纯度≥95%）购自Sigma-Aldrich。以β-石竹烯标准曲线定量α-姜烯和β-石竹烯。

3 结果

3.1 候选姜烯合酶基因筛选与克隆

基于温郁金转录组数据筛选出3个候选倍半萜合酶基因。系统发育分析显示，候选基因CwTPS8与催化FPP 1,11-环化的倍半萜合酶基因聚为一支，且与已功能鉴定的姜烯合酶基因ZSS1亲缘关系最近。而CwTPS9和CwTPS10可能分别产生无环倍半萜和1,10-环化产物。多序列比对显示CwTPS8具有I类萜类合酶保守的金属结合“DDxxD” motif、底物稳定“(N/D)Dxx(S/T)xxxE” motif以及环化倍半萜生物合成中终止碳正离子级联的保守碱性残基簇“RxR”。综合系统发育与保守域分析，表明CwTPS8编码具有特异性姜烯合成活性的1,11-环化型倍半萜合酶。

3.2 CwTPS8作为β-石竹烯/α-姜烯合酶的功能鉴定

将CwTPS8克隆至原核表达载体pMAL-His并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达。纯化后的重组蛋白与FPP底物孵育，GC-MS分析显示CwTPS8可将FPP转化为多种倍半萜产物，其中β-石竹烯（1）和α-姜烯（2）为主要产物。动力学参数为：α-姜烯K_m=28.17 μM，V_max=1.038 μM/min，K_cat/K_m=0.002 s^-1/μM；β-石竹烯K_m=27.99 μM，V_max=13.29 μM/min，K_cat/K_m=0.0254 s^-1/μM。

将CwTPS8克隆至真核表达载体pESC-Trp并转化至高FPP产量工程酵母菌株FY94，发酵产物GC-MS分析显示CwTPS8为多功能倍半萜合酶，可产生五种倍半萜化合物：β-石竹烯（1）、α-姜烯（2）、石竹烯醇（3）、新中介醇（4）和柳杉二醇（5）。综合功能表征表明，CwTPS8主要催化FPP的1,11-环化生成β-石竹烯、α-姜烯和石竹烯醇，同时具有次要的1,10-环化活性产生新中介醇和柳杉二醇。

3.3 影响产物生成的关键残基

通过分子对接分析CwTPS8与FPP的相互作用模式，并针对活性位点关键残基进行定点突变。芳香族氨基酸Trp273、Tyr375、Tyr403、Tyr520和Tyr526突变为丙氨酸后，W273A、Y403A、Y520A和Y526A突变体完全丧失酶活，Y375A突变体显著降低主要产物产量，表明芳香族侧链通过π-π堆积稳定碳正离子中间体的关键作用。脂肪族残基Ile294突变为丙氨酸后（I294A），产物形成急剧减少，仅检测到β-石竹烯和α-姜烯，表明Ile294等脂肪族残基通过疏水相互作用稳定底物中间体。

位于FPP焦磷酸基团附近的碱性残基Arg441、His393和His457突变为丙氨酸后，H393A和H457A突变体酶活显著降低，R441A突变体直接失活，表明这些带正电荷残基对萜类合酶活性至关重要。

通过与其它α-姜烯合酶和β-石竹烯合酶序列比对，发现CwTPS8第437位为苏氨酸（Thr437），而典型姜烯合酶该位点为保守丝氨酸。将Thr437突变为丝氨酸（T437S）后，α-姜烯产量增加37%，β-石竹烯产量降低，可能由于丝氨酸取代减少空间位阻，增强与相邻精氨酸的氢键网络，提高局部正电性，调控姜烯基碳正离子空间取向，促进去质子化生成α-姜烯。通过与β-石竹烯合酶比对发现三个相对保守氨基酸，构建S308G、S313L和C436S突变体。S308G和S313L突变导致酶活不同程度降低，而C436S突变使α-姜烯产量增加18%，β-石竹烯产量基本不变，可能与T437S突变类似，通过增强与相邻精氨酸的氢键影响姜烯基碳正离子淬灭。

3.4 候选短链脱氢酶基因克隆与生物信息学分析

在筛选姜烯酮生物合成途径中负责催化姜烯转化为8-羟基-α-姜烯的CYP450酶未果后，继续研究下游催化姜烯酮合成的短链脱氢酶（SDR）。从薰衣草、拟南芥和红球姜等植物中收集参与萜类脱氢产物生成的脱氢酶基因，结合转录组功能注释筛选出三个候选短链脱氢酶基因。系统发育分析显示候选基因CwSDR1与参考SDR聚为一支，提示其在萜类代谢中的保守催化作用。序列分析表明CwSDR1属于扩展型SDR，包含特征性Rossmann折叠、保守辅酶结合 motif“TGxxxGxG”和催化三联体“SYK” motif。

3.5 CwSDR1催化8-羟基-α-姜烯转化为姜烯酮

将CwSDR1克隆至真核表达载体pESC-Ura，与产8-羟基-α-姜烯的CYP71BA1共转化至高α-姜烯产量工程酵母菌株FY94-1。GC-MS分析显示，对照菌株（仅含CYP71BA1）发酵产物中未检测到8-羟基-α-姜烯，而有微量姜烯酮，可能由于不稳定的烯丙位仲醇在酵母弱酸性细胞内环境中自发转化。而在表达CwSDR1的工程菌中检测到显著姜烯酮峰，定量分析显示姜烯酮产量比对照菌株提高357%，表明CwSDR1是催化8-羟基-α-姜烯脱氢生成姜烯酮（6）的短链脱氢酶/还原酶。最终成功构建能够de novo合成抗癌化合物姜烯酮的菌株FY94-3，但姜烯酮产量仅0.50 μg/L（1.88 μg/g DCW），比生产率为0.03 μg/g DCW/h，这可能源于天然CYP450氧化酶CYP71BA1的有限催化效率。

4 讨论

本研究成功从温郁金中克隆并功能鉴定了两个关键萜类生物合成基因：多功能倍半萜合酶CwTPS8和短链脱氢酶/还原酶（SDR）CwSDR1。体外实验中，CwTPS8催化FPP转化为β-石竹烯（1）和姜烯酮前体α-姜烯（2）；在酿酒酵母中，CwTPS8除产生这些主要产物外，还生成柳杉二醇（5）及两个辅助倍半萜——石竹烯醇（3）和新中介醇（4）。酶CwSDR1被证实可脱氢8-羟基-α-姜烯生成姜烯酮（6）。通过分子对接和定点突变对CwTPS8进行机制研究，鉴定出调控催化活性的关键氨基酸残基，其空间构象改变将直接导致酶失活或大幅降低产物产量。

尽管β-石竹烯和α-姜烯是CwTPS8的主要产物，但α-姜烯的产量不理想限制了构建高产姜烯酮微生物底盘的应用。为解决这一瓶颈，未来工作将聚焦于通过分子动力学（MD）引导的理性设计和进化分歧分析对CwTPS8进行酶工程改造，结合定点突变优化催化特异性。同时，采用合成生物学策略——包括整合强组成型启动子和扩增质粒拷贝数——以提高α-姜烯合成效率。

CwSDR1催化姜烯酮产量不理想可能源于多个瓶颈：（1）P450羟化酶活性不足，限制前体供应；（2）NADPH再生能力不足，制约氧化还原辅因子可用性；（3）CwSDR1固有催化效率低。为解决这些限制，未来研究可采用QM/MM模拟阐明羟基化和氧化脱氢反应的机制细节，这些见解将指导底物通道工程和限速残基的靶向突变。并行策略包括：（1）通过过表达NAD+/NADH激酶和NADP+丙酮酸脱氢酶复合物增强NADPH循环以优化辅因子利用；（2）通过高通量筛选进化CYP450文库鉴定羟基化步骤的超活性变体进行酶工程；（3）通过动态调控磷酸戊糖途径重新平衡NADPH通量进行代谢重布线。

本研究全面阐明了姜烯酮生物合成途径中两个关键阶段：倍半萜骨架形成和末端功能化。此外，CwTPS8在体外和体内系统中均表现出催化杂泛性，从而扩展了倍半萜多样化的酶工具箱。这些发现为构建高产萜类酿酒酵母细胞工厂和优化姜烯酮生物合成效率奠定了理论基础。